人血白蛋白中蛋白质含量测定结果的不确定度评定

徐丰清，张 磊，刘明鹭

（1.青岛市黄岛区食品药品监督管理局，山东 青岛 266500；2.青岛市食品药品检验研究院，山东 青岛 266071）

1 仪器与试药

BUCH B-K314型定氮仪；0.005141 mol/L硫酸滴定液；人血白蛋白（批号：4312100816，规格：20%，50 mL，生产厂家：瑞士杰特贝林生物制品有限公司）；氯化钠、硫酸钾、硫酸铜、浓硫酸、氢氧化钠、硼酸、钨酸钠等，均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法

人血白蛋白中蛋白质含量测定按照中国药典2015年版三部[1]人血白蛋白品种项下规定，具体测定方法按照《中国药典》2015年版四部通则0731蛋白质含量测定法的测定法（2）[2]操作，照钨酸沉淀法制备非蛋白氮供试品溶液。然后仅以定氮仪作为蒸馏装置，其他按照0704氮测定法第二法（半微量法）进行。

总氮供试品溶液的制备：精密量取样品1 mL，置25 mL量瓶中，加0.9%氯化钠溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

非蛋白氮供试品溶液的制备：精密量取样品1 mL，置25 mL量瓶中，加水10 mL，加10%钨酸钠溶液2.5 mL，加0.33 mol/L的硫酸溶液2.5 mL，加水稀释至刻度，摇匀。静置30 min，滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得。

分别精密量取总氮供试品溶液和非蛋白氮供试品溶液各1 mL，置凯氏定氮瓶中，进行后续消化和蒸馏等操作。

接收液中加入5滴甲基红-溴甲酚绿指示液。溜出液用0.005141 mol/L的硫酸滴定液滴定。同时进行空白实验，并在结果中加以校正。

2.2 数学模型（见图1）

式中，Y为蛋白质的含量（mg/g）；V总氮、V非蛋白氮为样品消耗滴定液的体积（mL）；V0总氮、V0非蛋白氮为空白消耗滴定液的体积（mL）；F为硫酸滴定液的校正因子（0.005141/0.005）；1.401为折成氮原子的滴定度（mg/mL）；6.25为氮换算为蛋白质的系数；稀释倍数为供试品稀释倍数；M样为样品取样量（mL）；标示量为20%（20mg/100mL）。

2.3 测量不确定度的来源

2.3.1 移液管带入的不确定度

V移（mL）：转移溶液温度近20℃（以空调控制），温度影响可忽略。1 mL移液管的MPE=±0.007 mL，按矩形分布评定：u（移V）=0.007/=0.00404 mLurel（移V）=0.00404/1×100%=0.404%。

2.3.2 容量瓶带入的不确定度

V容（mL）：配制溶液温度近20℃（以空调控制），温度影响可忽略。25 mL容量瓶的MPE=±0.03 mL，按矩形分布评定：u（容V）=0.03/=0.0173 mL，urel（容V）=0.0173/25×100%=0.0692%。

2.3.3 滴定带入的不确定度

滴定时溶液温度近20℃（以空调控制），温度影响可忽略。

2.3.3.1 滴定样品带入的不确定度

25 mL滴定管MPE=±0.04 mL，按矩形分布评定：u（滴V）=0.04/=0.0231 mL。

因滴定样品和空白各2次，共4次，故应计算4次。V总氮=9.38 mL，V非蛋白氮=0.66 mL，V0总氮=0.70 mL，V0非蛋白氮=0.59 mL，（V总氮-V0总氮）-（V非蛋白氮-V0非蛋白氮）=8.61 mL。合成不确定度urel（滴V）=0.0462/8.61×100%=0.537%

2.3.3.2 滴定液带入的不确定度

滴定液为0.005141 mol/L 的硫酸滴定液，由0.05141 mol/L的硫酸滴定液稀释10倍而成，具体操作为精密量取10 mL，置200 mL量瓶中，稀释至刻度。

滴定液按照20℃扩展不确定度为0.05%（P=95%，k=2），所以urel（滴定液）=0.05%/2=0.025%。

20 mL移液管的MPE=±0.03 mL，u（移V）=0.03/=0.0173 mL，urel（移V）=0.0173/20×100%=0.0866%。

200 mL容量瓶的MPE=±0.15 mL，u（容V）=0.15/=0.0866 mL，urel（容V）=0.0866/200×100%=0.0433%。

滴定液带入的总的合成不确定度：urel（总滴定液）=0.100%。

2.3.3.3 滴定终点偏差

甲基红-溴甲酚绿指示液pH值变色点为5.1，酸度变化极微，终点判断误差可忽略不计。

综上，滴定引起的总不确定度为：

2.3.4 重复性测定的不确定度

蛋白质含量测定重复测定2次，结果分别为97.32%和97.87%，平均97.60%。

因测定次数少，标准差计算采用极差法，s=R/C，R为n次测定的极差，C是与n有关的系数，当n=2时，C=1.13。因此，s=（97.87%-97.32%）/1.13=0.487%。

2.4 不确定度合成（见表1）

表1 不确定度一览表

2.5 扩展不确定度

U（rel）=urel×2=0.768%×2=1.54%（k=2），本次人血白蛋白中蛋白质含量测定不确定度评定结果：U=97.60%×1.54%=1.50%，本次人血白蛋白中蛋白质含量测定结果：，本品蛋白质含量为标示量的（97.6%±1.5%）（k=2）。

3 讨 论

本次不确定度的评定中，样品滴定、样品量取和重复性测定是主要影响因素，样品稀释体积的影响较小。因人血白蛋白中蛋白质含量测定采用总氮减掉非蛋白氮的方法，样品滴定需要2次，增加了测定的不确定度。人血白蛋白中蛋白质含量测定法为半微量法定氮，量取体积较少，须使用1 mL移液管，故样品量取因素对不确定度影响也较大。重复性测定也是不确定度较大的影响因素，提示实验过程中，要特别注意蛋白沉淀、消化、蒸馏等环节，一定要注意蛋白沉淀完全，消化完全，蒸馏充分。另外实验人员操作水平，仪器设备的先进性，以及试剂等都是需要注意的因素。

[1] 中国药典2015年版.三部[S].2015:244.

[2] 中国药典2015年版.四部[S].2015:96.

[3] JJF1059.1-2012.测量不确定度评定与表示[M].北京:国家质量监督检验检疫总局,2012.