原发性干燥综合征气阴两虚证外周血单个核细胞中miR-155表达水平的研究

陈慕芝， 孙学斌， 巴哈尔古丽·力提甫， 照日格图， 孙红艳， 段沐含

(1新疆医科大学附属中医医院风湿科， 乌鲁木齐 830000； 2新疆医科大学第一附属医院骨科中心， 乌鲁木齐 830054；3新疆医科大学， 乌鲁木齐 830011)

原发性干燥综合征(primary sjogren′s syndrome,pSS)是一种以进行性外分泌腺损伤为特征的慢性炎症性自身免疫性疾病，本病发病机制至今未明，对其发病机制的探索一直是近年来研究的热点之一。microRNAs(miRNAs)是一类在进化上高度保守的非编码、小分子RNA，参与生物体的生长、发育、衰老、凋亡的调控及遗传背景的稳定[1]。miRNAs对机体免疫细胞具有多种调控功能，在固有免疫及适应性免疫中发挥重要作用，并参与自身免疫病的发病机制。Pauley等[2]研究发现pSS患者外周血单个核细胞(PBMC)中miRNA-155 的表达水平与健康人群相比有显著差异。pSS属中医学“燥证”范畴，全国中医痹病专业委员会认为本病应归属“燥痹”范畴，其病机是气阴两虚、脾气虚弱，但在其病机演变过程中，亦常兼夹湿热为患。临证时常分气阴两虚证、脾气虚弱证、湿热浸渍证等辨证论治[3]。本研究采用实时荧光定量PCR法检测miR-155在pSS患者及健康人PBMC中的表达水平，并分析pSS气阴两虚证与非气阴两虚证患者各临床项指标之间的差异，旨在探讨miR-155在pSS发病及疾病进展中的意义，并为进一步研究pSS患者的发病特点和中医辨证治疗提供理论指导。

1 资料与方法

1.1一般资料收集2015年3月-2015年12月在新疆医科大学附属中医医院风湿科就诊的pSS患者60例，其中男性2例，女性58例，年龄22～72岁，平均年龄(52.13±11.91)岁。所有pSS患者均符合2002年pSS患者国际分类诊断标准[4]，并除外：其他继发性干燥综合征患者，重度心肺功能不全患者，肝、肾、造血系统等严重原发性疾病患者，妊娠或哺乳期妇女及精神病患者；重叠其他风湿疾病患者。选取同期在本院体检的健康人30例，其中男性1名，女性29名，年龄22～74(52.24±10.76)岁。pSS患者和健康人在年龄及性别构成上差异无统计学意义(P>0.05)。本研究已获得新疆医科大学附属中医医院伦理委员会的批准，并已获得所有参与者的知情同意。

1.2方法

1.2.1 分组标准 对入选的pSS患者(pSS组)进行中医辨证分型，选出气阴两虚证患者和非气阴两虚证患者，各30例，气阴两虚证和非气阴两虚证患者中医诊断标准参照《实用中医风湿病学》[5]诊断标准，以同期在本院体检的健康人30例为对照(对照组)。

1.2.2 主要试剂 EasyPure miRNA Kit购于TransGen Biotech公司；TransScript miRNA RT Enzyme Mix购于TransGen Biotech公司。

1.2.3 microRNA提取 采集所有受试者空腹外周静脉血5 mL于EDTA抗凝管中，颠倒混匀数次，吸取200 μL转移至1.5 mL离心管中，加入1 mL LB10，震荡混匀，室温孵育5 min。加入200 μL氯仿，剧烈振荡30 s，室温孵育3 min，4℃，13 000 rpm离心10 min，转移上层水相至另一新的1.5 mL RNase free离心管，加入1/3体积的无水乙醇，轻轻颠倒混匀。将上述溶液与沉淀一起加入RNA Spin Column，14 000 rpm室温离心30 s，收集流出液转入新的1. 5 mL RNase free离心管中，加入1.25倍流出液体积的无水乙醇，轻轻颠倒混匀。将上述溶液与沉淀一起加miRNA Spin Column 14 000rpm室温离心30 s，弃掉流出液。加入500 μL WB10，14 000 rpm室温离心30 s，重复此步骤1次。室温14 000 rpm离心2 min，彻底去除残留的乙醇溶液。将RNA Spin Column放入1.5 mL RNase free离心管中，加入50 μL RNase free water于离心管中央，室温静置1 min。室温14 000 rpm离心1 min，洗脱miRNA后存储于-80℃冰箱用于反转录。

1.2.4 microRNA反转录 按照下列体系配制反转录反应：miRNA 5.0 μL，TransScript miRNA RT Enzyme MIX 1.0 μL，2×TS miRNA Solution Mix 10.0 μL，RNase Free Water补足至20.0 μL；轻轻混匀后离心10 s，37 ℃孵育 1 h,85℃加热5 s失活RT Enzyme MIX，迅速置于冰上冷却，短暂离心置冰上，加水稀释至100 μL。

1.2.5 PCR反应 反转录CDNA 1.0 μL,Forward primer (10 μM)与Universal miRNA qPCR Primer (10 μM)各0.4 μL，2×TransStart Tip Green qPCR Supermix 10.0 μL，Passive Reference Dye Ⅱ0.4 μL，RNase Free Water补足至20.0 μL。反应条件如下：94℃ 30 s 1个循环；94℃ 5 s,60℃ 34 s 40个循环。每个样本做3个复孔。采用公式: 2-△△Ct计算目的基因的相对表达量,△Ct=Ct(目的基因)-Ct(U6)，△△Ct=△Ct (实验样本) -△Ct (对照样本)。

1.2.6 观察和评价指标 pSS患者miR-155、病程、血沉(ESR)、血小板(PLT)、免疫球蛋白(IgA、IgG)及补体C3、C4。

2结果

2.1pSS组和对照组PBMC中miR-155相对表达水平的比较pSS组PBMC中miR-155的相对表达水平(0.910±0.153)较对照组(1.024±0.222)明显下调，差异有统计学意义(t= 2.519,P=0.016)。

2.2pSS气阴两虚证患者与非气阴两虚证患者PBMC中miR-155相对表达水平及临床各项指标的比较pSS气阴两虚证组患者PBMC中miR-155的相对表达水平低于pSS非气阴两虚证组，差异有统计学意义(P<0.05)；pSS气阴两虚证组病程、ESR、PLT、IgA、IgG及补体C3、C4与非气阴两虚证组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

3 讨论

pSS是一种以淋巴细胞增殖和进行性外分泌腺体损伤为特征的慢性炎症性自身免疫性疾病, 临床上以口干、眼干、疯狂样龋齿、反复腮腺肿大、关节痛为主要临床症状。本病起病隐匿，临床表现复杂多样，病情轻重差异较大，早期诊断、早期治疗可有效控制病情进展，减少脏器损害[6]，我国人群患病率为0.3%～0.7%[7]，男女的患病比例为1︰9[8],尤其以45～50岁为多见[9]。本病发病机制至今未明，对其发病机制的探索一直是近年来研究的热点。

表1 pSS气阴两虚证患者与非气阴两虚证患者PBMC中miR-155相对表达水平及临床各项指标的比较

microRNAs(miRNAs)是一类长度约22nt的内源性非编码、小分子单链RNA，高度保守，广泛存在于哺乳动物、植物、线虫及病毒中，参与生物体的生长、发育和凋亡，其命名规则为miR-﹟, ﹟为阿拉伯数字，高度同源的miRNAs，则在阿拉伯数字后面加上小写字母，如miR-146a、miR-146b等。目前人类基因组已识别约800个miRNAs，超过74%～92%的靶基因受miRNAs的调控[10]。miRNAs在固有免疫和适应性免疫细胞中通过特定的表达谱调节细胞功能，其表达和功能失调将导致疾病的发生，如癌症和自身免疫性疾病，近年来已有多项研究发现在一些自身免疫性疾病如类风湿关节炎[11-12]、系统性红斑狼疮[13-14]、干燥综合征[15-16]中存在相应的miRNA异常表达。

miR-155属于miRNAs家族中的一员, 是一个典型的多功能miRNA，位于人类21号染色体上B细胞非编码集合基因簇(BIC)的第3个外显子中[17]，它在T、B淋巴细胞应答中发挥重要作用[18], 同时，miR-155在炎症介导、抗原提呈、细胞因子生成的免疫过程中起着重要的调控作用[19-20]。鉴于miR-155对免疫系统的重要调控作用，有学者开始研究miR-155在自身免疫性疾病如类风湿关节炎、pSS、系统性红斑狼疮中的作用。2011年Pauley等[2]报道在人患者PBMC中miR-155表达上调。戚倩如等[21]研究发现，与健康对照组相比, pSS患者血清中miR-155 的表达量明显下调。本研究结果显示,miR-155在pSS患者PBMC中的表达水平明显低于对照组，表明miR-155与pSS的发病有明显相关性。但因样本量较小，尚需扩大样本量以进一步明确miR-155在pSS患者中的表达。

pSS在祖国医学中无病名记载，路志正教授在全国痹症专业委员会上称本病为“燥痹”，统一了本病的中医病名，使中医临床研究得以广泛展开。路志正教授认为本病的根本病机为气阴两虚，临证时以气阴两虚证为多见[22]。本课题组前期研究结果发现126例pSS患者中气阴两虚证最多,占80.95%[23]。这与杨佳等[24]的研究报道一致。本研究结果显示，pSS气阴两虚证患者PBMC中miR-155的相对表达水平低于pSS非气阴两虚证患者(P<0.05)；pSS气阴两虚证患者的病程较非气阴两虚证患者长、血沉水平较非气阴两虚证患者快，但差异均无统计学意义(P>0.05)；pSS气阴两虚证患者和非气阴两虚证患者在PLT、免疫球蛋白IgA、IgG及补体C3、C4等临床指标上差异均无统计学意义(P>0.05)。分析原因可能是与pSS气阴两虚证患者病程长、疾病活动度高及病情较重有关。与中医认为“久病燥邪入里，耗伤气阴，损及脏腑，属于病程后期”相一致，提示miR-155可能可以作为pSS疾病活动度的指标。

综上所述，miR-155与pSS的发病有明显相关性，pSS气阴两虚证患者PBMC中miR-155表达下调，提示miR-155可能可以作为pSS的新型临床标志物及疾病活动度的指标；但因本研究样本量较小，尚需扩大样本量以进一步研究miR-155在pSS中的具体调控机制。

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