一测多评法测定大鼠肠温孵液中意大利牛舌草4种成分的含量

税国莲， 滕 亮， 张文文， 马桂芝

(新疆医科大学1药学院， 乌鲁木齐 830011; 2第一附属医院药学部， 乌鲁木齐 830054)

意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz.)是紫草科(Boraginaceae)牛舌草属(AnchusaL.)多年生草木植物，具有调节异常黑胆质[1]、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗菌、抗炎、心血管保护等药理作用[2]。本课题组前期对意大利牛舌草进行了化学成分的研究，从其乙醇提取物中分离得到芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、迷迭香酸、苦莓苷、咖啡酸、胡萝卜苷、β-谷甾醇乙酸酯、β-谷甾醇等成分[3-4]，对其乙醇提取物抗缺氧/复氧心肌细胞氧化应激损伤的作用及机制进行了研究，结果表明意大利牛舌草乙醇提取物可能通过干预平衡氧化应激产物的生成和抗氧化应激的酶系统来减少缺氧/复氧所致原代心肌细胞氧化应激损伤[5]。本研究建立大鼠肠温孵液中意大利牛舌草主要成分(芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、迷迭香酸)的高效液相色谱定量分析方法，并以芦丁作为内参物，测定芦丁与山奈酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、迷迭香酸的RCF，利用RCF进行含量计算，并与外标法的测定结果进行比较，对QAMS法进行可行性验证,现报道如下。

1 材料

1.1仪器LC-20AB型高效液相色谱仪(日本岛津公司),New Classic MF型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司),Milli-Q型艾柯超纯水仪(美国密理博公司),SK2510HP型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。

1.2试药芦丁(成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-16031813，质量分数≥98.00%),山奈酚-3-O-芸香糖苷(成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-16041507，质量分数≥98.16%),水仙苷(成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-16070407，质量分数≥99.99%),迷迭香酸(成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-16040512，质量分数≥99.40%),乙腈、甲醇(美国Fisher公司，色谱纯),水为超纯水,其他试剂均为分析纯。8个批次的意大利牛舌草提取物为新疆医科大学药学院药物分析实验室自制。

1.3动物雄性SD大鼠，体质量(200±20)g，SPF级，新疆医科大学动物实验中心提供，生产许可证：SCXK(新)2016-0001，动物使用许可证：SYXK(新)2016-0002，饲养环境：光照12 h/d，温度(21±2)℃，湿度40%～45%，大鼠适应性饲养1 w。

1.4药材意大利牛舌草2015年1月购自新疆伊鼎辉煌生科技有限公司，经新疆医科大学药学院帕丽达·阿布力孜教授鉴定为紫草科意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz.)的干燥地上部分。

2 方法与结果

2.1提取物的制备取意大利牛舌草干燥地上部分，去除沙石等杂质，粉碎粉末过20目筛，用75%乙醇，料液比1∶20回流提取2次，每次2 h。取预处理好的聚酰胺湿法装柱，将1 BV的20 mg/mL意大利牛舌草粗提物溶液，以2 BV/h的速度上样，进行动态吸附，上样后静态吸附30 min，先用1 BV的蒸馏水除杂后，再用20 BV的70%乙醇分别以5 BV/h的速度洗脱，收集70%乙醇过柱液，减压浓缩，冷冻干燥，即为意大利牛舌草提取物。

2.2溶液的制备方法

2.2.1 对照品溶液的制备 分别取芦丁对照品、山奈酚-3-O-芸香糖苷对照品、水仙苷对照品、迷迭香酸对照品适量，精密称定，置10 mL容量瓶中，甲醇溶解定容，制得芦丁浓度为106 μg/mL、山奈酚-3-O-芸香糖苷浓度为101 μg/mL、水仙苷浓度为108 μg/mL、迷迭香酸浓度为389 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 K-R液的制备 分别称取NaCl 6.66 g、KCl 0.37 g、MgCl20.22 g、Na2HPO40.59 g、NaH2PO40.047 g、葡萄糖1.98 g、NaHCO32.1 g、CaCl20.14 g用超纯水定容至1 000mL，用1 mol/mL盐酸调pH值至7.40，备用。

2.2.3 空白肠温孵液的制备 分别取大鼠十二指肠、空肠、回肠、结肠肠段固定在尤斯灌流室两室中间，在两室中各加入5 mL已预热的K-R缓冲液，温孵1 h，于黏膜侧取出温孵好的空白肠温孵液，同时补充5 mL已预热的K-R缓冲液，维持漏槽条件，温孵1 h后，于黏膜侧取出孵好的空白肠温孵液，合并2次液体即得空白肠温孵液。

2.2.4 供试品溶液的制备 称取意大利牛舌草提取物5 mg至5 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容，得到浓度为1 mg/mL供试品储备液。肠粘膜孵育5 min后，分别在粘膜侧(供给池)加入5 mL 100 mg/mL的意大利牛舌草提取物溶液，浆膜侧(接受池)加入5 mL已预热的K-R缓冲液，分别于不同时间点于浆膜侧取样200 μL，4℃储存，备用。

2.3样品前处理精密量取肠温孵液200 μL，加200 μL甲醇，涡旋混匀2 min，4℃下12 000 r/min离心10 min，取上清液过滤，备用。

2.4外标法方法学考察

2.4.1 色谱条件 Cromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0～9 min，83%B→80%B；9～20 min，80%B→68%B；20～40 min，68%B→40%B；40～45 min，40%B→83%B)；流速1.0 mL/min；检测波长354 nm；柱温30℃；进样量20 μL。在该色谱条件下，各目标物质与相邻色谱峰分离度良好，见图1-4。

图14种目标物质混合对照HPLC色谱图

图2空白肠温孵液HPLC色谱图

( a芦丁；b山奈酚-3-O-芸香糖苷；c水仙苷；d迷迭香酸)

图3空白肠温孵液加混合对照品溶液HPLC色谱图

图4给药120min后的肠液HPLC色谱图

(a芦丁；b山奈酚-3-O-芸香糖苷；c水仙苷；d迷迭香酸) (a芦丁；b山奈酚-3-O-芸香糖苷；c水仙苷；d迷迭香酸)

2.4.2 标准曲线的制备 量取“2.2.1”项下混合对照品溶液5 mL至10 mL容量瓶，以甲醇为溶剂倍量稀释，得到系列浓度标准溶液；分别量取1 mL系列浓度溶液至5 mL容量瓶中，用空白肠温孵液稀释得到芦丁(0.08、0.16、0.33、0.66、1.32、2.65、5.30、10.60、21.20 μg/mL)，山奈酚-3-O-芸香糖苷(0.08、0.16、0.32、0.63、1.26、2.52、5.05、10.10、21.10 μg/mL)，水仙苷(0.08、0.17、0.33、0.67、1.34、2.68、5.35、10.70、21.40 μg/mL)，迷迭香酸(0.30、0.61、1.22、2.43、4.86、9.73、19.45、38.90、77.80 μg/mL)的肠液样品。按“2.3”项下操作，按照“2.4.1”项下色谱条件进样分析，分别以肠温孵液中4种成分的浓度(X)对峰面积(Y)进行线性回归，得4种成分的标准曲线，见表1。

2.4.3 准确度与精密度试验 分别精密量取高、中、低浓度混合对照品溶液，按“2.4.2”项下方法配成低、中、高3个质量浓度的质控样品，进行5样本分析，连续测定5 d，记录峰面积，测定质控样品浓度，计算回收率、日内精密度及日间精密度，见表2。

2.4.4 稳定性试验 分别量取高、中、低浓度混合对照品溶液适量，按“2.4.2”项下方法配成低、中、高3个质量浓度的质控样品，按“2.3”项下方法处理，分别于处理后的0、2、4、6、8、10、12、14 h，按“2.4.1” 项下色谱条件分别进样分析。14 h内测得各目标成分浓度RSD均<20%，表明样品溶液进行前处理后在14 h内稳定性良好。

2.4.5提取回收率试验 分别量取高、中、低浓度混合对照品溶液适量，按“2.4.2”项下方法配成低、中、高3个质量浓度的质控样品，进行5样本分析，记录各目标成分峰面积(A)；取空白肠温孵液，按”2.3”项下方法处理，分别量取高、中、低浓度混合对照品溶液，用已处理好的空白肠温孵液稀释定容至刻度，使其质量浓度与A组相同。按“2.4.1” 项下色谱条件分别进行5样本分析，得到各成分峰面积(B)，以A/B计算提取回收率并求出RSD值。试验结果表明4种成分的提取回收率在80%～120%，RSD值均<20%，符合分析方法学的要求，见表3。

表1 4种成分线性范围及检测限(n=5)

表2 精密度和准确度试验结果(n=5)

表3 提取回收率试验结果(n=5)

2.5一测多评法量取“2.2.1” 项下混合对照品溶液1 mL置5 mL容量瓶，用空白肠温孵液稀释定容至刻度，按“2.3” 项下方法处理，按“2.4.1” 项下色谱条件分别进样2、4、8、12、16、20 μL，测定各成分峰面积和保留时间。以芦丁为内参物，根据相对校正因子计算公式fi/s=fi/fs=(Ai/Ci)/(As/Cs)(其中Ai为待测成分i的峰面积，Ci为待测成分i的浓度，As为内参物的峰面积，Cs为内参物s的浓度)，相对保留值计算公式RRT=Ti/Ts(其中Ti为某待测成分保留时间，Ts为内参物保留时间)分别计算山奈酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、迷迭香酸与内参物芦丁之间的相对校正因子和相对保留值，见表4。

表4 相对校正因子(RCFs)、相对保留值(RRT)测定结果

注：a 芦丁；b 山奈酚-3-O-芸香糖苷；c 水仙苷；d 迷迭香酸

2.6一测多评法与外标法含量测定结果比较称定意大利牛舌草提取物5 mg至5 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容，得到浓度为1 mg/mL供试品储备液。分别精密量取各批次供试品溶液1 mL至5 mL容量瓶，用空白肠温孵液稀释定容至刻度，按“2.3” 项下方法处理，按“2.4.1” 项下色谱条件分别进样。采用ESM法测定8个批次的大鼠肠温孵液中意大利牛舌草提取物主要成分芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、迷迭香酸的平均含量分别为14.20、15.88、9.80、66.90 mg/g。在线性范围内，芦丁与山奈酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、迷迭香酸的RCF分别为0.983、1.101、0.843。利用RCF计算得山奈酚-3-O-芸香糖苷、水仙苷、迷迭香酸的平均含量分别为15.67、9.87、67.44 mg/g，见表5。

表5 QAMS法与ESM法测定大鼠肠温孵液中意大利牛舌草4种成分含量(mg/g)

3 讨论

一测多评法是利用中药化学成分间内在的函数关系和比例关系，在只采用1个对照品(价廉、易得者)的基础上，实现对多个成分(昂贵、难得者)同步测定的方法。是一种适合中药特点的多成分定量方法，特别适用于对照品难得或不稳定的情况[6]。从2006年对单味药中同一类化学成分的研究开始，该方法已成功运用于栀子[7]等药材以及杜麻颗粒[8]等复方制剂的含量测定。在2010年版《中国药典》一部[9]中，已经收录运用QAMS法测定黄连中生物碱的含量。在2015年版《中国药典》一部[10]中，新增了运用QAMS法测定丹参以及生姜中目标成分的含量。

芦丁是意大利牛舌草中的含量较高的成分之一，化学性质较稳定，对照品来源有保障且价廉易得，故选作内参物，能更好地体现一测多评法低成本、易操作的特点。迷迭香酸在测定过程中易降解，其含量随着时间的延长而明显下降，其含量下降可能是因光照而发生分解[11]，因此试验过程中应避光处理，且样品前处理后应立即测定。色谱峰定性时，可采用相对保留值法和保留时间差法对待测组分的色谱峰进行定位，试验中2种方法均能准确定位色谱峰，但相对保留值法是目前综合效果最好，应用最广泛的定性方法。故本试验采用相对保留值法定位色谱峰。

[1] 木拉提·克扎衣别克,BRIGITTE K,SONJA P,等.异常黑胆质成熟剂中各单味药对HL-60细胞增殖的抑制作用[J].科技导报,2009,27(19):94-98.

[2] 何媛媛,王金凤,郭丽娜,等.意大利牛舌草化学成分及药理作用研究进展[J].环球中医药,2017,10(1):114-120.

[3] 常文,代己果,马桂芝.意大利牛舌草化学成分的初步研究[J].安徽农业科学,2015,43(10):85-86.

[4] 路文杰,程雪梅,滕亮,等.多指标综合评分法优选意大利牛舌草总黄酮的提取工艺[J]. 上海中医药杂志,2016,50(12):89-93.

[5] 代己果,万琪臻,马桂芝,等.意大利牛舌草乙醇提取物抗缺氧/复氧心肌细胞氧化应激损伤的研究[J].新疆医科大学学报,2017,40(3):356-360.

[6] 王智民,钱中直,张启伟,等.一测多评法建立的技术指南[J].中国中药杂志,2011,36(6):657-658.

[7] LIN SX,ZHANG QH,XI PY,etal.Determination of six ingredients in gardenia jaminoides fruit with quantitative analysis of muti-components by single marker[J].J of Chinese Med Mater，2015,38(3):531-535.

[8] 杨东亮,马桂芝,王娟,等.一测多评法测定杜麻颗粒中5种成分的含量[J].西北药学杂志,2015,30(3):247-251.

[9] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：中国医药科技出版社,2010：285.

[10] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：中国医药科技出版社,2015：76,101.

[11] 侯建春,吕晓玲,周平,等.迷迭香酸的稳定性研究[J].食品研究与开发,2009,30(3):44-48.