阿托伐他汀对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织Wnt4/β-catenin信号通路的干预作用

李圆圆 石春花 石明隽 张昌志 曾令萍 肖 瑛 郭 兵

(贵州医科大学病理生理教研室，贵州 贵阳 550025)

Wnt信号通路在各种器官纤维化上皮细胞向间充质细胞转分化(EMT)过程中扮演重要作用，该信号通路的异常激活与心脏、肾脏、肺等器官纤维化的发生发展密切相关〔1～3〕。Wnt4是Wnt家族蛋白之一，对泌尿生殖系统发展至关重要〔4〕。阿托伐他汀是新近使用的高效他汀类降脂药物，有研究提示，他汀类可通过多种途径发挥抗炎、抗纤维化等肾脏保护作用〔5〕，但具体机制仍不明确。本实验通过观察阿托伐他汀药物对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠Wnt4/β-catenin信号通路的影响，探讨阿托伐他汀改善肾纤维化的可能机制。

1 材料和方法

1.1动物 清洁级SD大鼠，雌雄各半，体重(200±20)g，贵州医科大学动物中心提供，合格证号：SCXK 2007-0005。

1.2试剂 阿托伐他汀钙片(阿乐，北京嘉林药业)，牛血清蛋白、超敏电化学发光法(ECL)、一抗稀释液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(北京碧云天)，二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、兔抗-E-cadherin、兔抗-α-平滑肌自身抗体(SMA，武汉博士德)，两步法免疫组化检测试剂、辣根过氧化物标记羊抗兔IgG，鼠抗-β-actin(北京中杉金桥)，兔抗-β-catenin、兔抗-Wnt4(北京博奥森公司)，兔抗-糖原合成激酶(GSK)-3β、兔抗-p-GSK-3β(美国Santa Cruz)。

1.3实验方法

1.3.1UUO大鼠模型复制 参考薛痕等〔6〕方法，采用8%水合氯醛，按5 ml/kg剂量腹腔注射麻醉大鼠，剑突下4 cm做腹正中切口(约5 cm)，钝性分离皮下组织及肌层，展开止血钳托住输尿管中上段，4-0号丝线在相距1 cm的距离分别结扎输尿管的两端，从结扎两端的中点位置将输尿管剪断，缝合皮肤。术后1～2 h大鼠清醒，6 h后给予进水，12 h后予进食。

1.3.2分组 将60只SD大鼠，雌雄各半，在清洁条件下适应性喂养1 w，常规饮食饮水。随机分为假手术组、模型组和阿托伐他汀组，各组又分别设有7 d组和14 d组，每组10只。治疗组术前3 d予10 mg·kg-1·d-1阿托伐他汀生理盐水混悬液2 ml灌胃，假手术组及模型组予等体积生理盐水灌胃。分别于术后7 d、14 d处死各组大鼠，取术侧肾，常规固定，制片，染色。

1.3.3肾组织形态学检查 4%中性甲醛固定肾脏组织制成3 μm厚石蜡包埋切片，HE染色后光镜下观察肾脏形态学结构，PAS染色和Masson染色观察肾组织纤维化病变。

1.3.4免疫组化染色 制备好的大鼠肾组织石蜡切片采用两步法免疫检测试剂盒进行免疫组化染色，镜下观察Wnt4和β-catenin蛋白在大鼠肾组织表达。

1.3.5Western印迹检测 按组织裂解液说明书步骤提取蛋白，BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。取相应量的蛋白液和1.5倍SDS配置成统一浓度样品，混匀后100℃加热10 min，保存于-20℃备用，使用前煮沸3 min，上样，转膜，封闭，孵育一抗过夜，分别为：GSK-3β(1∶500)、p-GSK-3β(1∶600)、Wnt4(1∶200)、β-catenin(1∶300)、α-SMA(1∶200)、E-cadherin(1∶150)、Collagen-1(1∶200)、β-actin(1∶400)，TBST洗膜5 min 3次。孵育特定二抗1 h，洗膜后ECL显影曝光。检测各蛋白相对表达量。

1.4统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1大鼠肾组织病理学改变 HE、PAS染色见假手术组大鼠肾小球、肾小管结构清晰，肾小管排列紧密，肾小管周围间质无增宽，模型各组大鼠术后7 d起观察到肾小管管腔扩张，肾小管周围间质增宽、水肿并伴有大量炎性细胞浸润，随梗阻时间延长更加严重。但梗阻早期肾小球结构相对完整，阿托伐他汀组较同期模型组上述病变有所改善。Masson染色见假手术组肾小球基底膜、系膜区及肾小管间质无明显胶原沉积，模型组见增宽的间质充满着大量蓝紫色条索状胶原，随梗阻时间延长加重。阿托伐他汀组较同期模型组胶原沉积减少，见图1。

图1 HE、PAS和Masson染色观察各组肾组织14 d形态学改变(×200)

2.2免疫组化学染色结果 假手术组肾组织中未见Wnt4表达，β-catenin蛋白仅少量表达于肾组织中细胞与细胞的连接处，模型组Wnt4高表达于肾小管上皮细胞胞质中，β-catenin蛋白在肾小管上皮细胞和肾小球上皮细胞的胞质中均有表达，阿托伐他汀组Wnt4的表达明显减少，β-catenin蛋白表达较同期的模型组减少。见图2。

图2 Wnt4和β-catenin在各组肾组织表达(DAB，×400)

2.3Wnt4和β-catenin蛋白在大鼠肾皮质的表达 Wnt4和β-catenin蛋白在假手术组大鼠肾皮质的表达极少，UUO成模7 d后，Wnt4和β-catenin蛋白表达开始增多(P<0.05)，成模14 d表达进一步增高，明显高于同时间点假手术组(P<0.05)； 阿托伐他汀组7 d时Wnt4和β-catenin 蛋白表达与同期模型组无明显变化(P>0.05)，阿托伐他汀组14 d时，Wnt4、β-catenin蛋白表达较同期模型组显著减少(P<0.05)。见图3，表1。

1～5：假手术组、模型组7 d、阿托伐他汀组7 d、模型组14 d、阿托伐他汀组14 d，下图同图3 Wnt4和β-catenin蛋白在各组大鼠肾皮质的相对表达

2.4GSK-3β和p-GSK-3β蛋白质大鼠肾皮质的表达 GSK-3β蛋白在各组大鼠肾皮质的表达无统计学差异(P>0.05)，p-GSK-3β蛋白在假手术组大鼠肾皮质中无表达，与假手术组相比，模型组7 d时p-GSK-3β蛋白表达显著增多(P<0.01)，14 d时p-GSK-3β蛋白仍维持在高于假手术组(P<0.01)；与同期模型组相比，在阿托伐他汀组7 d时p-GSK-3β蛋白表达明显减少，14 d时p-GSK-3β蛋白的表达较同时点模型组减少更显著(P<0.05)。见图4，表1。

图4 p-GSK-3β/GSK-3β蛋白在各组大鼠肾皮质表达

2.5E-cadherin、α-SMA和CollagenⅠ蛋白在肾皮质的表达 假手术组大鼠肾皮质E-cadherin蛋白呈高表达，α-SMA、Collagen Ⅰ蛋白无表达，与假手术组相比，UUO成模7 d时，E-cadherin蛋白表达显著减少(P<0.01)，α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达显著增多(P<0.01)，UUO 14 d时α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达进一步增多(P<0.01)；与模型组7 d相比，给予阿托伐他汀治疗7 d后E-cadherin蛋白的表达有所增多，α-SMA和CollagenⅠ蛋白的表达有所下降，但均不显著，治疗14 d后与同期模型组相比E-cadherin蛋白的表达明显多(P<0.05)，α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达水平明显减少(P<0.05)。见表1，图5。

表1 阿托伐他汀对单侧输尿管梗阻大鼠Wnt4及相关蛋白表达影响

与假手术组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组7 d比较：3)P<0.05；与模型组14 d比较：4)P<0.05

图5 E-cadherin、α-SMA和CollagenⅠ蛋白在各组大鼠肾皮质的表达

3 讨 论

肾小管间质纤维化是各种慢性肾脏疾病进展至终末期肾病的主要病理基础与共同通路，涉及机制十分复杂，目前尚未充分阐明。研究认为EMT是肾小管间质纤维化的重要机制，在各种刺激因素的作用下，细胞外基质(ECM)代谢失调及间质细胞的增殖凋亡失衡是肾小管间质纤维化的重要原因〔7〕，故抑制EMT的发生和减少ECM的沉积对延缓慢性肾病纤维化的发生发展至关重要。 EMT作为肾小管间质纤维化的重要机制，其发生发展受多种细胞因子、生长因子及信号通路的共同调节。近年研究发现，Wnt/β-catenin信号通路在促进肾小管间质纤维化EMT的发生发展中发挥重要的作用〔8〕。β-catenin为经典Wnt/β-catenin信号通路的核心分子，在没有Wnt 信号作用时，β-catenin能被胞质内中由GSK-3β、结肠腺瘤性息肉蛋白(APC)、轴蛋白(Axin)等构成的破坏复合体中的GSK3β磷酸化，磷酸化后的β-catenin可被E3泛素连接酶识别进而被蛋白酶体泛素化降解，从而使胞内游离的β-catenin处于相对较低的水平，阻止了Wnt信号的传导；在有Wnt信号时，Wnt 信号传入胞内与细胞表面受体Frizzled和共受体 LRP5/6 结合，使胞质中的Dsh发生活化，经过一系列的信号传递使β-catenin的破坏复合体中有活性的GSK-3β发生磷酸化生成无活性的p-GSK-3β蛋白，p-GSK-3β不能使β-catenin蛋白发生磷酸化，逃脱磷酸化的β-catenin蛋白在胞质中不断积累，到一定量后发生核转移与核转录因子T细胞因子淋巴增强因子(TCF/LEF)相结合，调节Wnt/β-catenin信号通路下游致纤维效应靶基因的表达〔9〕，促进UUO大鼠肾脏EMT的发生和肾间质ECM的沉积。

阿托伐他汀是细胞内胆固醇合成关键酶羟基三甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA)抑制剂，能抑制细胞内胆固醇的合成，同时还通过受体途径促进肝脏对低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的摄取，使血胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平降低，因而被广泛用于动脉粥样硬化和冠心病等血管疾病的防治中。近年研究发现，他汀类药物不仅具有降脂的作用，同时还具有抗氧化、抗炎肾脏保护作用等非降脂途径作用。彭红霞等〔10〕在UUO模型研究中发现，阿托伐他汀可能通过减少PI3K/AKT信号通路的活化，减轻转化生长因子(TGF)-β1致纤维化效应，改善肾脏纤维化病变。Wnt/β-catenin信号通路的激活在UUO大鼠肾纤维化发生发展中起到了重要作用,阿托伐他汀通过多种途径抑制肺、心肌等纤维化发生也有相关报道〔11,12〕，但阿托伐他汀是否可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路激活，发挥其抗肾纤维化作用目前未见相关报道。

本研究表明阿托伐他汀可以下调Wnt4蛋白的表达，从而减少或阻止了Wnt信号从胞外传导至胞质中，故GSK-3β不发生磷酸化，未磷酸化的GSK-3β对β-catenin蛋白有磷酸化作用，磷酸化的β-catenin蛋白可被E-3泛素连接酶识别并被泛素化降解，进而抑制Wnt/β-catenin信号通路传导，抑制下游致纤维化效应靶基因的表达，延缓了UUO 肾脏EMT的发生和ECM的沉积，改善肾脏纤维化病变，阿托伐他汀抗UUO大鼠肾纤维化病变可能与其抑制Wnt4/β-catenin信号通路的激活和传导有关。

1Duan J,Gherghe C,Liu D,etal.Wnt1/beta catenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair〔J〕.EMBO J，2012;31(2):429-42.

2Cisternas P,Vio CP,Inestrosa NC,etal.Role of Wnt signaling in tissue fibrosis lessons from skeletal muscle and kidney〔J〕.Curr Mol Med,2014；14(4):510-22.

3苏金玲，姜希娟，郭茂娟，等.β连环蛋白在大鼠酒精性肝纤维化中的表达及意义〔J〕.中国老年病学杂志,2013;33(13):3097-8.

4Di Rocco DP,Kobayashi A,Taketo MM,etal.Wnt4/β-catenin signaling in medullary kidney myofibroblasts〔J〕.JASN,2013;24(9):1399-412.

5Yang B,Hodgkinson AD,Shaw A,etal.Protective effect of statin therapy on connective tissue growth factor induction by diabetes in vivo and high glucose in vitro〔J〕.Growth Factors,2013;31(6):199-208.

6薛 痕,樊均明,陈 亮，等.大鼠肾间质纤维化动物模型的实验研究〔J〕.四川动物,2004;23(1):16-21.

7Tan RJ,Zhou D,Zhou L,etal.Wnt/b-catenin signaling and kidney fibrosis〔J〕.Kidney Int Suppl,2014;4(1):84-90.

8Kim MK,Maeng YI,Sung WJ,etal.The differential expression of TGF-β1,ILK and wnt signaling inducing epithelial to mesenchymal transition in human renal fibrogenesis:an immunohistochemical study〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2013;6(9):1747-58.

9Xiao L,Wang M,Yang S,etal.A Glimpse of the pathogenetic mechanisms of Wnt/β-Catenin signaling in diabetic nephropathy〔J〕.Biol Med Res Int,2013;2013：1-7.

10彭红霞,陈 明,张 超，等.Akt信号蛋白在阿托伐他汀作用于UUO大鼠肾小管-间质中的表达〔J〕.中国病理生理杂志,2008;24(6):1231-3.

11魏路清,刘 斌,李振华，等.阿托伐他汀对肺纤维化大鼠MMP-9/TIMP-1表达的影响〔J〕.基础医学与临床,2011;31(1):91-2.

12李瑞芳,方伟进,曹珊珊，等.阿托伐他汀对心肌纤维化影响的实验研究及其作用机制〔J〕.中国临床药理学杂志,2014;7(30):594-7.