广西人群IL-22基因多态性分布特征及其与血脂的关系*

王 荣， 覃海媚， 黄华佗， 陆玉兰， 蓝 艳， 韦贵将， 郭 静， 韦叶生△

(右江民族医学院附属医院 1检验科， 2皮肤科， 3右江民族医学院， 广西 百色 533000)

白细胞介素(interleukin，IL)-22是IL-10家族成员，又被称为IL-10相关T细胞源性可诱导因子(IL-10-related T cell-derived inducible factor，IL-TIF)，被Dumoutier等[1]发现于2000年。IL-22主要由活化T淋巴细胞和NK细胞等合成，分布于全身多处组织器官，具有广泛的免疫学功能，尤其在调节T细胞介导的免疫反应时起关键作用[2]。近年来，IL-22基因多态性与疾病的关系越来越受到重视，而不同遗传背景的人群在同一疾病中的易感性存在差异。目前，已有报道和IL-22属于同一家族的IL-10基因多态性与动脉粥样硬化和缺血性脑卒中等疾病密切相关[3-5]。然而，有关IL-22基因多态性和血脂密切相关疾病间关系的研究尚未见报道。因此，我们探讨广西人群中IL-22基因rs2227485C/T和rs2227491A/G位点多态性分布特征及与其他人群的差异，并进一步分析不同基因型人群的血脂水平差异，为我国人群的基因多态性数据库构建提供资料，也可为广西人群高血脂预防及与这些位点相关疾病的深入探讨奠定基础。

材 料 和 方 法

1 研究对象

随机选取右江民族医学院附属医院体检中心280例健康者，排除有心脏病、中风及血脂异常等病史，其中包括男性103例，女性177例，年龄18～78岁，研究个体均世居广西地区，无血缘关系。研究方案通过我院伦理委员会审批，受试者均知情并签署同意书。

2 方法

2.1样本DNA的提取 抽取各研究对象静脉血3 mL，EDTA-K2抗凝。按DP318型血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根公司)说明书提取样本DNA，-20 ℃保存。

2.2引物的合成 参照GenBank中IL-22基因rs2227485C/T和rs2227491A/G的核苷酸序列，使用Primer 3.0在线软件设计实验引物，由上海天昊生物科技有限公司合成。rs2227485C/T位点上游引物序列为5’-GCCCGGAGGGTATTTTACAGACA-3’，下游引物为序列5’-TGGTAGGAAAATGAGTCCG- TGACC-3’，延伸引物为序列5’-TTTTTTTTTTTTT- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCGTGACCAA-AATGCTTACTCAG-3’；rs2227491A/G位点上游引物序列为5’-TCTGCAGGTGGAA GGGAAACAG-3’，下游引物为序列5’-GACGTTCGTCTCATTGGGGAGA-3’，延伸引物为5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-TTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGTGTAAGCTACAGTTGTG-ACGAAC-3’。

2.3基因分型 PCR反应体系总共20 μL，包括 1.0 μL样本DNA、2.0 μL缓冲液、2.0 μL dNTPs、1 U TapDNA聚合酶及上、下游引物各1.0 μL，剩余体积添加灭菌双蒸水。使用热启动Taq DNA聚合酶(HotStarTaq DNA polymerase； Qiagen)进行多重PCR扩增。获得的PCR产物经虾碱性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase， SAP；Promega)和核酸外切酶I (exonuclease I， EXOI； Epicentre)纯化后用SNP基因分型试剂盒SNaPshot Multiplex kit (ABI)进行延伸反应，延伸产物采用SAP纯化后在ABI 3730XL全自动DNA测序仪上样，并用GeneMapper 4.1 (Applied Biosystems)分析。DNA测序法验证上述分型结果。

2.4血脂指标检测 研究对象均禁食12 h，次日清晨空腹，坐位采集静脉血3 mL，离心后获取血清。分别使用血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和极低密度脂蛋白胆固醇(very-low-density lipoprotein cholesterol，VLDL-C)的试剂盒在HITACHI 7600型生化分析仪上测定。

3 统计学处理

数据分析采用SPSS 17.0统计学软件包。正态分布的计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，两样本均数间的比较用t检验，多样本均数比较采用F检验。直接计数法统计各位点的基因型频率与等位基因频率。基因多态性分布差异的比较采用χ2检验。Hardy-Weinberg遗传平衡定律验证样本人群是否有代表性。以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 rs2227485C/T位点和rs2227491A/G位点基因分型

经检验，这2个位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，说明选取的人群有代表性。 rs2227485C/T和rs2227491A/G的PCR扩增长度分别为166 bp和159 bp。分型结果显示，rs2227485C/T位点有CC、CT和TT 3种基因型；rs2227491A/G位点有AA、AG和GG 3种基因型。测序结果充分证实了分型结果，见图1、2。

Figure 1. The sequencing map ofIL-22 gene rs2227485C/T site. ①～③ indicated CC, TT and CT genotypes, respectively.

图1IL-22基因rs2227485C/T位点测序图

Figure 2. The sequencing map ofIL-22 gene rs2227491A/G site. ①～③ indicated AA, AG and GG genotypes, respectively.

图2IL-22基因rs2227491A/G位点测序图

2 广西人群中IL-22基因2位点的基因多态性分布

rs2227485C/T位点CC、CT和TT基因型及C和T等位基因频率分布在男女2组间比较差异无统计学显著性(P>0.05)；rs2227491A/G位点AA、AG和GG基因型及A和G等位基因频率分布在男女2组间比较差异无统计学显著性(P>0.05)，见表1。

表1 广西人群IL-22基因rs2227485C/T和rs2227491A/G位点基因型和等位基因频率的分布

3 各位点与其它种群的基因多态性比较

分析显示，广西人群rs2227485C/T位点各基因型和等位基因的分布频率与意大利(TSI)、北京(HCB)、日本(JPT)和墨西哥(MEX)人群比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；广西人群rs2227491A/G位点基因型分布频率与意大利、日本和墨西哥人群之间对比，差异有统计学意义(P<0.01)，与北京人群相比，差异无统计学显著性(P>0.05)，其等位基因分布频率与意大利、北京、日本和墨西哥人群相比差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2、3。

4 IL-22基因2个位点基因型与血脂水平的关系

经检验，IL-22基因2个位点中3种基因型与研究对象间年龄及性别的差异无统计学显著性(P>0.05)。rs2227485C/T位点3种基因型间各项血脂指标水平的差异均无统计学显著性(P>0.05)；rs2227491A/G位点3种基因型间HDL-C和LDL-C的差异有统计学意义(P<0.05)，其中，与GG组比较，AG和AA组中HDL-C水平差异有统计学意义(P<0.05)，与AA组比较，AG和GG组中LDL-C水平差异有统计学意义(P<0.05)，见表4、5。

表2广西人群IL-22基因rs2227485C/T位点基因型和等位基因分布频率与其它种族的比较

Table 2. Comparison of genotype and allele frequencies ofIL-22 gene rs2227485C/T site in Guangxi people with other ethnic populations

GroupnGenotypefrequencyPAllelefrequencyPCCCTTTCTGuangxipeople28048(17.1%)138(49.3%)94(33.6%)234(41.8%)326(58.2%)HapMap-TSI17642(23.9%)96(54.5%)38(21.6%)0.015180(51.1%)172(48.9%)0.006HapMap-HCB8618(20.9%)52(60.5%)16(18.6%)0.03088(51.2%)84(48.8%)0.030HapMap-JPT17056(32.9%)78(45.9%)36(21.2%)<0.001190(55.9%)150(44.1%)<0.001HapMap-MEX10030(30.0%)52(52.0%)18(18.0%)0.002112(55.3%)88(44.7%)<0.001

表3广西人群IL-22基因rs2227491A/G位点基因型和等位基因分布频率与其它种族的比较

Table 3. Comparison of genotype and allele frequencies ofIL-22 gene rs2227491A/G site in Guangxi people with other ethnic populations

GroupnGenotypefrequencyPAllelefrequencyPAAAGGGAGGuangxipeople28045(16.1%)148(52.8%)87(31.1%)238(42.5%)322(57.5%)HapMap-TSI17642(23.9%)94(53.4%)40(22.7%)0.046178(42.9%)174(57.1%)0.017HapMap-HCB8618(20.9%)52(60.5%)16(18.6%)0.07388(51.2%)84(48.8%)0.046HapMap-JPT17056(32.9%)78(45.9%)36(21.2%)<0.001190(55.9%)150(44.1%)<0.001HapMap-MEX10026(26.0%)54(54.0%)20(20.0%)0.029106(53.0%)94(47.0%)0.010

表4 IL-22基因rs2227485C/T位点基因型的血脂指标比较

表5 IL-22基因rs2227491A/G位点基因型的血脂指标比较

*P<0.05vsAA;#P<0.05vsGG.

讨 论

IL-22基因位于第12号染色体长臂上(12q15)，处在IL-26和IFNG位点上游大约52 bp和99 bp处，含6个外显子及5个内含子，长度为6 kb，编码含179个氨基酸残基的蛋白质[6]。人类IL-22与IL-10的相似度为22.8%，与大鼠IL-22的相似度为80.8%[7]。血脂异常是冠状动脉粥样硬化的独立危险因素之一，脂质代谢异常导致内皮损伤是其发生发展的重要因素。IL-22下游信号由JAK-STAT及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase， MAPK)信号通路介导[8]。JAK-STAT信号通路已被明确证实与动脉粥样硬化进程中的氧化应激、细胞损伤和凋亡有关，并参与Fas、IL-8及IL-6这些凋亡因子的基因调控，而MAPK通路更是与血管平滑肌细胞表型转换、迁移与增殖密切相关，且参与很多炎症因子的基因调控，这提示IL-22可能参与机体的病理性免疫应答反应，从而加剧AS进程。Rattik等[9]对敲除IL-22基因小鼠喂食高胆固醇14周后发现，这组小鼠的主动脉根部形成的AS斑块面积和对照组相比明显减少，且斑块的胶原蛋白水平明显下降，而平滑肌细胞中的α-actin蛋白表达升高。

我们的研究发现，IL-22基因rs2227485C/T位点在广西人群中，其多态性分布频率与意大利人、北京人、日本人和墨西哥人比较，差异均有统计学意义；IL-22基因rs2227491A/G位点多态性与这4个人群相比也有差异。这可能是由于广西位于我国西南边界，长期和外界环境相对隔绝，遗传背景单纯[10]。进一步分析这些位点与血脂指标关系时，发现rs2227491A/G位点3种基因型间HDL-C和LDL-C的差异有统计学意义，HDL-C水平在A等位基因携带者(AG/AA)与GG基因型比较差异有统计学意义，LDL-C水平在G等位基因携带者(AG/GG)与AA基因型之间比较差异有统计学意义。这提示我们研究广西人群中IL-22基因多态性和血脂相关疾病时，可以优先考虑rs2227491A/G位点。rs2227485C/T和rs2227491A/G位点位于IL-22基因内含子区域，内含子上的突变可能会影响基因转录，从而调控基因的表达，以此参与各种疾病的病理生理过程[11-12]。然而，尚无学者研究IL-22基因多态性与血脂相关疾病的关系。

综上所述，我们对广西人群IL-22基因rs2227485C/T位点和rs2227491A/G位点多态性进行探讨，并比较了其在不同人群之间的分布差异，丰富了IL-22基因多态性在我国人群的遗传学资料。分析其多态性与血脂间的关系可为疾病的研究提供数据支持。当然，我们的研究还存在不足：样本量较小，来源单一，仅探讨了多态性和常规血脂指标的关系。因此，进一步探讨IL-22基因多态性与血脂相关疾病的关系将是今后的一个方向。

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