南方红豆杉枝叶紫杉烷类萃余物中黄酮苷类成分研究

李兆慧，高兴兴，喻晓雁，阮晓，王强*

(1.浙江医药高等专科学校中药学院，浙江 宁波 315100；2.浙江大学宁波理工学院生化分院，浙江 宁波 315100)

红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus)又名紫杉，为常绿乔木或灌木植物。红豆杉属植物全世界有11个种，主要分布于北半球温带、寒温带以及热带、亚热带高山地区[1-2]。红豆杉属植物中主要有三大类物质，分别是以紫杉醇、10-DAB、三尖杉宁碱为代表的紫杉烷类化合物、紫杉黄酮及红豆杉多糖[1,3]。1971年，Wani等最早从短叶红豆杉(Taxusbrevifolia)中分离得到Taxol，并证实其具有显著的抗肿瘤活性[4]。此后，紫杉醇因其在乳腺癌、卵巢癌治疗等方面取得的良好效果得到广泛关注和深入研究。目前工业制备紫杉醇一般以红豆杉枝叶为原料,提取10-DAB半合成紫杉醇和多西紫杉醇。在提取制备10-DAB的过程中，剩余大量的红豆杉枝叶紫杉烷类萃余物(TREFT)[5]已被证实含有丰富的黄酮类化合物。黄酮类化合物具有抗癌[6]、抗肿瘤[7]、抗氧化[8]、清除自由基[9]、抗心血管疾病[10]等独特的生物活性，已被广泛应用于医药、食品等行业。

目前已从红豆杉属植物中分离鉴定出20余种黄酮类及双黄酮类化合物[1]，包括阿曼托黄酮[11]、槲皮素[12]、银杏素[13]、金松双黄酮[13]、榧双黄酮[13]等。为充分开发利用工业废弃物TREFT，本课题组深入研究南方红豆杉枝叶TREFT中的黄酮苷类化合物，并分离鉴定3种黄酮苷化合物，分别为山奈酚3-O-β-D-鼠李糖(1‴→6″)-β-D-葡萄糖苷(1)、槲皮素3-O-芸香糖苷(2)、山奈酚 3-O-α-L-阿拉伯糖(1‴→6″)-β-D-葡萄糖苷(3)，其中化合物1和3首次从红豆杉属植物中分离得到。

1 材料

1.1 材料和试剂

TREFT粉末由宁波泰康红豆杉生物工程有限公司提供，置干燥器内室温保存。

柱色谱硅胶(100～200目)、GF254薄层层析硅胶(青岛海洋化工厂)；AB-8大孔吸附树脂(上海摩速学器材有限公司)；ODS填料(50 μm，YMC公司)；乙腈(Tedia公司，色谱纯)；分析纯试剂(北京化学试剂公司)；氘代甲醇(Aladdin试剂有限公司)；三蒸水(自制)。

1.2 仪器

Agilent 1290 infinity超高效液相色谱仪(DAD二极管阵列检测器，Agilent ZORBAX Eclipse C18柱,2.1 mm×150 mm,1.8 μm，美国Agilent公司)；UV1800紫外可见分光光度计(日本岛津公司)； Bruker Avance AV 400超导核磁共振谱仪(Brucker公司)；Brucker micro OTOF-Q质谱仪(Brucker公司)；AL204电子分析天平(梅勒特-托利多仪器有限公司)。

2 提取与分离

800 g TREFT粉末，料液比1∶20 g/mL加70%乙醇，45℃下超声提取30 min，提取3次，提取液减压浓缩至1 L，石油醚除去色素、油脂等，即得紫杉黄酮粗提物(22.07 g)。紫杉黄酮粗提物经AB-8大孔树脂，依次用3 BV 10%、40%、60%乙醇梯度洗脱，流速2 BV/h，UPLC检测合并得3个部位Fr.1、Fr.2、Fr.3。Fr.2经硅胶柱色谱(100～200目)，依次用乙酸乙酯：甲醇(15∶1，9∶1，0∶1)洗脱，UPLC检测合并得到3个部位Fr.2-1、Fr.2-2、Fr.2-3。Fr.2-2经重结晶技术得化合物1(28.3 mg)。Fr.2-3经减压ODS柱，依次用甲醇-水(1∶9，4∶5，5∶4，7∶3)洗脱，UPLC检测合并，经重结晶技术得化合物2(36.2 mg)和化合物3(15.7 mg)。

3 结构鉴定

化合物1，黄色粉末，分子式为C27H30O15，ESI-MS (m/z)=593.2 [M-H]-。1H-NMR(Methanol-d4，600 MHz)δ：8.06(2H，d，J=8.7 Hz，H-2′，6′)，6.89(2H，d，J=8.6 Hz，H-3′，5′)，6.39(1H，s，H-8)，6.20(1H，s，H-6)，5.11(1H，d，J=7.1 Hz，H-1″)，4.52(1H，br，s，H-1‴)，3.81(1H，d，J=10.5 Hz，H-6″)，1.13(3H，d，J=6.2 Hz，H-6‴)。13C-NMR(Methanol-d4，151 MHz)δ：180.56(C-4)，167.45(C-7)，164.15(C-5)，162.70(C-9)，160.57(C-4′)，159.72(C-2)，136.75(C-3)，133.61(C-2′，6′)，123.96(C-1′)，117.38(C-3′，5′)，106.79(C-10)，105.96(C-1″)，103.64(C-1‴)，101.31(C-6)，96.22(C-8)，79.38(C-4″)，78.40(C-5″)，76.97(C-3″)，75.15(C-2″)，73.50(C-3‴)，73.30(C-4‴)，72.64(C-2‴)，70.96(C-5‴)，69.81(C-6″)，19.15(C-6‴)。上述数据与文献报道基本一致[14]，故鉴定化合物1为山奈酚3-O-β-D-鼠李糖(1‴→6″)-β-D-葡萄糖苷。

化合物2，黄色粉末，分子式为C27H30O16，ESI-MS(m/z)=609.1 [M-H]-。1H-NMR(Methanol-d4，400 MHz)δ：7.80-7.58(m，2H，H-2′，6′)，6.90(1H，d，J=8.3 Hz，H-5′)，6.42(1H，s，H-8)，6.23(1H，s，H-6)，5.13(1H，d，J=7.4 Hz，H-1″)。13C-NMR(Methanol-d4，151 MHz)δ：180.58(C-4)，167.36(C-7)，164.13(C-5)，160.54(C-9)，159.70(C-2)，151.03(C-3′)，147.03(C-4′)，136.85(C-3)，124.81(C-6′)，124.33(C-1′)，118.94(C-5′)，117.30(C-2′)，106.80(C-10)，105.98(C-1″)，103.64(C-1‴)，101.25(C-6)，96.17(C-8)，79.39(C-5″)，78.40(C-3″)，76.95，(C-2″)，75.17(C-4‴)，73.47(C-4″)，73.32(C-2‴)，72.61(C-3‴)，70.94(C-5‴)，69.79(C-6″)，19.13(C-6‴)。上述数据与文献报道基本一致[15-17]，故鉴定化合物2为槲皮素3-O-芸香糖苷。

化合物3，黄色粉末，分子式为C26H28O15，ESI-MS (m/z)=579.2 [M-H]-。1H-NMR(Methanol-d4，400 MHz)δ：8.02(2H，d，J=8.8 Hz，H-2′，6′)，6.80(2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′)，6.32(1H，s，H-8)，6.11(1H，s，H-6)，5.10(1H，d，J=7.5 Hz，H-1″)，3.96(1H，d，J=6.9 Hz，H-1‴)，3.82(1H，m，H-6″)。13C-NMR(Methanol-d4，151 MHz，)δ：179.49(C-4)，166.22(C-7)，163.08(C-5)，161.69(C-4′)，158.83(C-9)，158.56(C-2)，135.62(C-3)，132.35(C-2′，6′)，122.74(C-1′)，116.28(C-3′，5′)，105.76(C-10)，104.83(C-1‴)，104.13(C-1″)，100.00(C-6)，94.92(C-8)，78.11(C-5″)，78.03(C-3″)，75.79(C-2″)，74.06(C-3‴)，72.39(C-2‴)，71.47(C-4″)，69.49(C-6″)，69.17(C-4‴)，66.61(C-5‴)。上述数据与文献报道基本一致[18]，故鉴定化合物3为山奈酚3-O-α-L-阿拉伯糖(1‴→6″)-β-D-葡萄糖苷。

[1] 王亚飞,王强,阮晓,等.红豆杉属植物资源的研究现状与开发利用对策[J].林业科学,2012,48(5):116-125.

[2] 檀丽萍,陈振峰,中国红豆杉资源[J].西北林学院学报,2006,21(6):113-117.

[3] 刘建慧，马生军，马留纯，等.海南和四川不同生长年限曼地亚红豆杉3种紫彬烷类活性成分的比较研究[J].中医药信息，2017,34(6):9-13.

[4] WANI M C,TAYLOR H L,WALL M E,et al.Plant antitumor agents.6.Isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia[J].J Am Chem Soc,1971,93(9):2325-2327.

[5] RUAN X,ZHAN L M,GAO X X.Separation and purification of flavonoid from Taxus remainder extracts free of taxoids using polystyrene and polyamide resin[J].J Sep Sci,2013(36):1925-1934.

[6] HADDAD A Q,VENKATESWATAN V,VISWANATHAN L,et al.Novel antiprolife-rative flavonoids induce cell cycle arrest in human prostate cancer cell lines[J].Prostate Cancer Prostatic Dis,2006,9(1):68-76.

[7] BRUSSELMANS K,VROLIX R,VERHOEVEN G,et al.Induction of cancer cell apoptosis by flavonoids associated associated with their ability to inhibit fatty acid synthase activity[J].J Bio Chem,2005,280(7):5636-5645.

[8] ABRAHAM L C N,MASAKUNI T,ISAO H,et al.Antioxidant flavonoid glycosides from the leaves of Ficus pumila L[J].Food Chem,2008,109(2):415-420.

[9] BEN AMMAR R,BHOURI W,BEN SGHAIER M,et al.Antioxidant and free radical-scavenging properties of three flavonoids isolated on the leaves of Rhamnus alaternus L.(Rhamnaceae):A structure-activity relationship study[J].Food Chem,2009,116(1):258-264.

[10] AVIRAM M,FUHRMAN B.Wine flavonoids protect against LDL oxidation and athemsclemsis[J].Ann N Y Acad Sci,2002,957:146-161.

[11] 邱林刚.西藏红豆杉的双黄酮[J].植物学报,1989,31(1):54-56.

[12] TACHIBANA S,MATSUO A,ITOH K,et al.Extractives in the leaves and bark of Taxus cuspidata Sieb.et Zucc.var.nana Rehder[J].Mokuzai Gakkaishi,1994,40(9):1008-1013.

[13] TATSUO K,TOKUNOSUKE S.Flavonoids of the leaves of Coniferae and allied plants.I.Flavonoid from the leaves of Torreya nucifera[J].Yakugaku Zasshi,1958(78):1010-1013.

[14] FALODUN A,QADIR M I,CHOUDHARY M I.Isolation and characterization of xanthine oxidase inhibitory constituents of Pyrenacantha staudtii[J].Acta Pharmaceutica Sinica,2009,44(4):390-394.

[15] DAI X,HUANG Q,ZHOU B,et al.Preparative isolation and purification of seven main antioxidants from Eucommia ulmoides Oliv.(Du-zhong) leaves using HSCCC guided by DPPH-HPLC experiment[J].Food chemistry,2013.

[16] KAZUMA K,NODA N,SUZUKI M.Malonylated flavonol glycosides from the petals of Clitoria ternatea[J].Phytochemistry,2003,62(2):229-237.

[17] MAJINDA R R T,MOTSWALEDI M,WAIGH R D,et al.Phenolic and antibacterial constituents of Vahlia capensis[J].Planta medica,1997,63(3):268-270.

[18] XIE C,VEITCH N C,HOUGHTON P J,et al.Flavonoid glycosides and isoquinolinone alkaloids from Corydalis bungeana[J].Phytochemistry,2004,65(22):3041-3047.