PCR技术在布鲁氏菌检测与鉴别中的应用

秦立得，南文龙，陈义平

（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

布鲁氏菌病（Brucellosis，以下简称布病）是由布鲁氏菌（Brucella）引起的一种人兽共患病。布鲁氏菌分为10个种型：6种经典型菌种，即羊种、牛种、猪种、绵羊附睾种、沙林鼠种和犬种；4种新发现种型，即B.microti、B.ceti、B.inopinata和B.pinnipedialis[1-2]。它们可感染猪、牛、犬、羊、鼠、骆驼等多种哺乳动物，其中羊种、牛种和猪种可感染人。

常用的布鲁氏菌病原检测方法包括布鲁氏菌分离培养和分子生物学方法[3]。布鲁氏菌分离培养是布鲁氏菌检测和种型区分的金标方法，但该方法耗时长，并需要在生物安全三级实验室中进行[4]。分子生物学病原检测技术具有安全可靠、灵敏度高、特异性强、操作简便等特点，已开始在布鲁氏菌检测中推广应用[5-6]，其中研究最多的是聚合酶链式反应（PCR）方法。PCR方法已广泛应用于布病诊断、环境及动物产品的布鲁氏菌检测、布鲁氏菌分型等方面，能从全血、血清、组织、体液等多种样品，以及牛奶、奶酪、生肉等食品中检出布鲁氏菌，而且能从患病初期血清学阴性样品中检出病原，从而弥补了血清学检测方法的不足[7]。

1 通用型布鲁氏菌PCR检测方法

通用型布鲁氏菌PCR检测方法包括普通PCR、巢式PCR和荧光定量PCR等。1990年，Fekete等[8]首先开发出检测布鲁氏菌的PCR方法，证明PCR方法具有灵敏度高、特异性强的优点。通用型布鲁氏菌PCR检测方法常检测的保守基因包括16S-23S rRNA基因[9]、omp2基因[10]、bcsp31基因[11]、IS6501（IS711）重复序列[12]和per基因[13]等。大量的比对验证表明，这些基因检测结果的敏感性存在差异。

2007年，Manal等[14]使用bcsp31基因引物（B4/B5）、omp2基因引物（JPF/JPR）和16S-23S rRNA基因引物（F4/R2），检测147份阳性血清和50份阴性血清。结果显示，这3对引物检测结果的特异性强，但敏感性存在差异。其中：B4/B5引物敏感性最高为98%（144/147），最低检出限为700 CFU/mL；JPF/JPR引物敏感性为88.4%（130/147），最低检出限为7×105CFU/mL；F4/R2引物敏感性为53.1%（78/147），最低检出限为7×107CFU/mL。

2009年，Bounaadja等[15]根据IS711、bcsp31和 per基因，建立了3种布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法，并与检测相同基因的普通PCR和巢式PCR方法进行了比对试验。结果显示，上述荧光定量PCR方法较普通PCR和巢式PCR方法灵敏度提高了50～500倍，IS711、bcsp31和 per基因荧光定量PCR方法最低检出限分别为0.2、2和2 fg布鲁氏菌基因组，但这3种方法在检测不同种型布鲁氏菌时存在敏感性差异。

2 不同种型布鲁氏菌PCR检测鉴别方法

2.1 多重PCR

多重PCR是布鲁氏菌种型检测与鉴定的常用方法。1994年，Bricker等[16]根据高度保守的IS711重复序列在不同种型布鲁氏菌基因组中的数量和分布特点，设计了通用型IS711引物和不同种型布鲁氏菌引物，建立了能同时检测1型、2型和4型牛种布鲁氏菌，羊种布鲁氏菌，绵羊附睾种布鲁氏菌和1型猪种布鲁氏菌的多重PCR（AMOS PCR）。随后Bricker等[17]又在上述方法中增加了两对引物，使该方法能够区分牛种布鲁氏菌疫苗株S19株和RB51株。2000年，Ewalt等[18]使用AMOS PCR方法检测经分离培养确定为牛种布鲁氏菌的231份样品，发现检测结果与布鲁氏菌分离培养鉴别结果一致。目前，AMOS PCR已得到广泛认可，并在布鲁氏菌检测、种型鉴别和流行病学调查中得到广泛应用。

近年来多重PCR方法在AMOS PCR的基础上又有了进一步发展。2006年，García-Yoldi等[19]开发出能区分经典型布鲁氏菌种型和亚种，牛种布鲁氏菌疫苗株S19和RB51，以及羊种布鲁氏菌疫苗株Rev1的多重PCR。2009 年，Huber等[20]开发出不仅能实现之前此类多重PCR检测的效能，并能区分牛种布鲁氏菌1、2、4型与 3、5、6、9型，猪种布鲁氏菌1、3、4型与2、5型的多重PCR。2010年，Mayer-Scholl等[21]进一步完善了该方法，设计了能检测区分包括B.microti、B.inopinata、B. ceti和B.pinnipedialis在内的目前已知的所有种型布鲁氏菌多重PCR方法。

2.2 不同种型荧光定量PCR

最初建立的布鲁氏菌不同种型检测与鉴别荧光定量PCR方法的目的基因，往往选择经多重PCR方法确认的相应序列，由此开发出了牛种、猪种和羊种布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法。2007年，Ai Dahouk等[22]对比了2种羊种布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法、3种牛种布鲁氏菌和1种猪种布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法，检测了248份已知样品（包括各型布鲁氏菌菌株、临床分离布鲁氏菌菌株和68株其他菌株）。检测结果表明：这些方法特异性强，与检测同种布鲁氏菌的荧光定量PCR方法灵敏度相同，其中羊种布鲁氏菌基因组最低检出限为16 fg，猪种为100 fg，牛种为18 fg；检测敏感性存在差异，羊种布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法可检测所有种型羊种布鲁氏菌样。Redkar等[23]开发的牛种和猪种布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法只能单独检测1型、2型、4型和部分6型牛种布鲁氏菌和1型猪种布鲁氏菌。

随着对布鲁氏菌全基因序列的深入研究，布鲁氏菌的不同种型和生物型的特异性核酸多态性位点或特异性序列相继被发现，并依此开发了相应的荧光定量PCR检测鉴别方法。

2008年，Hinić等[24]根据不同种型布鲁氏菌特异性序列，建立了通用型布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法，羊种、猪种、牛种、绵羊附睾种、沙林鼠种和犬种6种布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法，通过样品检测发现，只有猪种、沙林鼠种和绵羊附睾种布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法特异性强。

2010年，Winchell等[25]分析总结出7种布鲁氏菌的特异性单核氨酸多态性位点，建立了能检测区分羊种、猪种、绵羊附睾种、沙林鼠种、犬种和感染海洋生物的布鲁氏菌（B.ceti和B.pinnipedialis）的荧光定量PCR方法，证明以上方法的最低检测限分别为100、1、100、10、100和10 fg布鲁氏菌基因组；使用以上方法检测153份样品，证明这些方法具有良好的特异性和敏感性。

2015年，Vahhab等[26]根据牛种和羊种布鲁氏菌的种特异性核酸位点，建立了能检测区分牛种和羊种布鲁氏菌的荧光定量PCR方法，发现该方法对牛种和羊种布鲁氏菌基因组最低检出限均为1.5 pg；使用该方法检测160份临床样品和17株非布鲁氏菌菌株，证明其具有良好的特异性和敏感性。

2016年，Kim等[27]发现牛种布鲁氏菌基因组种特异性突变位点，建立了能检测并区分牛种布鲁氏菌的荧光定量PCR方法，发现该方法最低检出限为20 fg或4 CFU牛种布鲁氏菌基因组；使用该方法检测296株已知布鲁氏菌菌株和8株非布鲁氏菌菌株，结果检测出了所有牛种布鲁氏菌菌株。

2017年，Kaden等[28]发现羊种布鲁氏菌基因中存在种特异性核酸缺失，以此建立了能检测区分羊种布鲁氏菌的荧光定量PCR方法，发现该方法最低检测限约为6.25个布鲁氏菌基因组；使用该方法检测120份人类临床分离羊种布鲁氏菌、37株布鲁氏菌代表型菌株和45株非布鲁氏菌菌株，证明其具有良好的特异性和敏感性。

2.3 不同生物型荧光定量PCR

2015年，Hänsel等[29]发现猪种布鲁氏菌1～4型有特异性重复序列，而后建立了能检测猪种布鲁氏菌1～4型荧光定量PCR方法，发现该方法最低检测限为12.5 fg布鲁氏菌基因组DNA；使用该方法检测25份各种型布鲁氏菌基因组样品、75份已知猪种布鲁氏菌分离株样品和30株非布鲁氏菌样品，发现该方法特异性强，对布鲁氏菌1～4生物型检出率为95%。

2.4 其他PCR方法

1996年，Ouahrani-Bettache等[30]根据IS711序列在不同种型布鲁氏菌基因组中分布的多态性，建立了能区分多种布鲁氏菌和疫苗株B19的锚定PCR方法。2012年，Mirnejad等[31]设计能同时检测区分牛种和羊种布鲁氏菌的PCR方法（RFLPPCR），通过对PCR产物进行限制性内切酶酶切，可进一步分析结果。此外，将限制性片段长度多态性分析、多位点可变数目串联重复序列分析、随机扩增多态性DNA技术、芯片技术等与PCR技术相融合并应用于布鲁氏菌种型或菌株的检测与鉴别，都取得了理想的效果。

3 布鲁氏菌疫苗菌株PCR检测鉴别方法

接种弱毒疫苗是控制布病的有效方法。常见的疫苗包括牛种布鲁氏菌19（S19）、4520（4520）疫苗，羊种布鲁氏菌Rev.1疫苗，猪种布鲁氏菌S2疫苗，粗糙型牛种布鲁氏菌株51（RB51）疫苗等。目前，多种布鲁氏菌弱毒疫苗在我国布病防控中发挥了积极作用，但也出现了干扰诊断等问题，而PCR方法可区分弱毒疫苗株与野生型菌株。

3.1 普通PCR

1994 年，Sangari等[32]发现牛种布鲁氏菌弱毒疫苗株 B19存在702 bp的基因缺失，并依此设计了检测B19弱毒疫苗株的PCR方法。1999 年，Vemulapalli等[33]发现牛种布鲁氏菌弱毒疫苗株RB51存在特异性的IS711基因插入，因此建立了能检测弱毒疫苗株RB51的PCR方法。2002 年，Cloeckaert等[34]发现羊种布鲁氏菌弱毒疫苗株Rev.1存在特异性基因突变，设计了能检测Rev.1弱毒疫苗株的PCR方法。此外，还将上述布鲁氏菌疫苗菌株普通PCR检测方法有效整合于布鲁氏菌快速检测和分型的多重PCR方法中[18-21]。

2014年，Nan等[35]建立能检测区分猪种布鲁氏菌弱毒疫苗株S2的双重PCR方法，发现检测猪种布鲁氏菌1型时产生285 bp条带，检测S2时产生285和497 bp两条带。该方法最低检出限为27 fg猪种布鲁氏菌1型菌株基因组和60 pg S2弱毒疫苗株基因组。

3.2 荧光定量PCR

2016年，Nan等[36]发现牛种布鲁氏菌弱毒疫苗株A19菌株存在特异性位点，以此设计了能检测区分A19疫苗株的荧光定量PCR方法，发现该方法最低检出限为7.6 fg A19疫苗株布鲁氏菌基因组；使用该方法检测79株已知布鲁氏菌菌株、125份阳性血清样品和4株非布鲁氏菌菌株，证明其具有良好的特异性和敏感性；2018年，Nan等[37]还发现牛种布鲁氏菌弱毒疫苗株104M存在特异性的基因突变，以此设计了能检测区分104M疫苗株的荧光定量PCR方法，发现该方法最低检出限为220 fg 104M疫苗株基因组。

4 结语

布鲁氏菌PCR方法与传统的血清学和细菌学检测方法相比具有简便快捷、特异性强、灵敏度高、操作简便等优点，其检测结果得到了广泛接受和认可。目前多重PCR和荧光定量PCR在布鲁氏菌检测、布鲁氏菌菌种鉴别、疫苗株与野毒株区分等方面得到了广泛应用，满足了检验检疫、流行病学调查、人和动物布病诊断等多方面的需求。目前，PCR技术又实现了与芯片技术、微流体技术等新技术的融合，可进行大量样品中多种病原的快速同步检测和分析，有效提高了检测效率，将更有助于布鲁氏菌的快速检测和分型。