羊口疮病毒B2L基因密码子优化及截短表达

张 静，范峻豪，刘春羽，赵 一，温永俊，张七斤

（内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010018）

羊口疮（ORF）是由羊口疮病毒（ORFV）感染山羊和绵羊引起的一种急性、接触性传染病，人偶有感染。本病以羊口唇、乳房等处的皮肤和粘膜形成红斑、丘疹、脓疮、溃疡和结痂等为主要特征[1-2]。ORFV全基因组大小为135～139 kb，为双链线性DNA病毒，基因组包含131个基因，其中B2L基因位于基因组的左末端。病毒在宿主细胞内增值时，B2L基因在病毒DNA尚未开始复制时便大量转录翻译42 ku大小的蛋白。该蛋白是ORFV外囊膜的主要成分，可强烈刺激宿主免疫系统产生免疫应答[3-4]。

本研究截短表达了ORFV B2L基因，并依照大肠杆菌密码子偏好进行密码子优化，使其在原核表达系统中进行融合表达，纯化出高浓度重组蛋白，为后续建立ORFV血清学检测方法提供了重要的抗原物质，尤其是为建立ORFV间接ELISA方法奠定了物质基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

Ni-NTA Agarose亲和纯化柱、Binding Buffer和Elution Buffer：购自生工生物工程（上海）有限公司；180 ku蛋白预染 Marker：购自Thermo公 司；Anti-His Mouse mAb、100 ku蛋 白 预 染Marker：购自全式金生物技术有限公司；Anti-Mouse IgG：购自SIGMA；PVDF膜：购自Bio-Rad；蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、BeyoECL Plus：购自上海碧云天生物技术有限公司；BL21（DE3）感受态细胞：购自天根生化科技（北京）有限公司。其他试剂均为标准化学分析纯试剂。

1.2 主要仪器

Trans-Blot SD半干转印槽：美国Bio-Rad公司；Alph Imager HPr凝胶成像系统：美国Protein Simple公司；双垂直蛋白电泳仪：中国百晶生物公司；脱色摇床：中国五相仪器仪表公司。

1.3 B2L蛋白截短及密码子优化

运用DNA Star中的Protean软件，分析B2L蛋白的亲水性、可塑性、蛋白表面可及性、抗原指数；根据分析结果截取抗原指数高、亲水性好、可塑性好的片段进行截短表达和密码子优化；将优化好的片段送吉林库美生物有限公司进行合成，然后连接到pET32a（+）表达载体上，再转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中。

1.4 重组蛋白表达

将重组菌划线接种于含Amp+的LB固体培养基37 ℃过夜培养，将过夜菌挑单菌落接种于3 mL含氨苄抗性的新鲜 LB液体培养基，摇菌培养12 h；按1%的比例将纯化培养的菌液接种于200 mL含Amp+的新鲜LB液体培养基，37 ℃ 200 r/min震荡培养；用分光光度计测A到0.6时，加入IPTG诱导；将菌液12 000 r/min离心10 min，弃上清，用Binding buffer洗涤2次，然后重悬，于冰浴中进行超声破碎（具体以超声菌液清亮为止）；将超声裂解菌液4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，分离上清和沉淀；将沉淀用尿素溶解，经过SDS-PAGE电泳测定，并且以未诱导菌为阴性对照。

1.5 重组蛋白纯化

将Ni-NTA Agarose亲和纯化柱加入5 mL Binding Buffer平衡10次，将蛋白加入平衡好的Ni-NTA镍柱填料中，在冰上结合30 min；收集流穿液，加5 mL Binding Buffer洗涤1次，收集洗涤液，加Elution Buffer 5 mL洗1次，收集洗脱液。

1.6 重组蛋白Western-blot鉴定

将经SDS-PAGE电泳的蛋白条带转印到PVDF膜上，电压14 V 1 h；用5%脱脂乳室温封闭2 h，然后用10 mmol/L PBST洗3次，每次10 min；在膜上加入Anti-His Mouse mAb为一抗（1∶4 000稀释），4 ℃过夜孵育，第2天用10 mmol/L PBST洗3次，每次10 min；再将膜放入1∶5 000稀释的Anti-Mouse IgG中孵育1 h，取出膜后用10 mmol/L PBST洗3次，每次10 min；在PVDF膜上加ECL显影液，放于荧光显色仪中显色。

2 结果与分析

2.1 B2L蛋白截短及密码子优化

2.1.1 B2L蛋白截短 利用DNA Star中的Protean软件，分析B2L蛋白的亲水性、可塑性、蛋白表面可及性、抗原指数等，选取抗原指数高、亲水性好、可塑性好的片段进行截短表达。分析结果见图1-A，截取的目的蛋白氨基酸序列见图1-B。

图1 B2L蛋白的生物信息学分析

2.1.2 B2L蛋白截短基因的密码子优化 根据大肠杆菌的密码子偏好进行密码子优化，用E.coli Codon Usage Analyzer 2.1在线软件分析优化结果。结果显示（图2），优化后的密码子适应指数（CAI）为1，且无稀有密码子。CAI是反映编码区同义密码子与密码子最佳使用相符合的程度，取值范围在0～1之间，越高表明该基因的密码子使用偏好性越强[7-8]。

图2 密码子优化分析结果（CAI为1）

2.3 重组蛋白SDS-PAGE分析

将重组表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态中，经条件优化，最终确定37 ℃ IPTG终浓度为1 mmol/L诱导培养3 h后表达的效果最佳。SDS-PAGE检测结果见图3。从结果中可以看出，诱导的pET32a（+）-B2L重组菌超声后上清及沉淀中的30 ku附近出现清晰条带，而未诱导的PET-32a-B2L重组菌在这一位置没有这一条带，因此认为B2L重组蛋白得到了成功表达。

图3 SDS-PAGE检测结果

2.4 重组蛋白纯化

将诱导表达得到的B2L蛋白经镍柱亲和层析后收集到的流穿液、洗涤液和洗脱液，分别取20 µL进行SDS-PAGE电泳，可以看出流穿液和洗涤液中也有 重组蛋白存在，但洗脱液中的重组蛋白单一，因而认为重组蛋白得到较好的纯化（图4）。

图4 SDS-PAGE电泳结果

2.5 重组蛋白Western-blot检测

Western blot结果见图5。纯化的蛋白在30 ku附近出现1条清晰条带，而未诱导的重组菌和诱导的空表达载体菌没有出现目的条带，表明重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。

图5 Western-blot结果

3 讨论

目前，羊口疫广泛流行于全球各羊养殖国家或地区，且发生频率逐年上升，流行范围逐渐扩大，特别是我国黑龙江、新疆、内蒙古、西藏、青海、吉林等养殖地区，近年频频暴发羊口疫疫情[5]，给养羊业造成了一定的经济损失，同时鉴于国内缺乏相关检测试剂盒，故应给予羊口疫更高的关注。本试验通过PET-32a（+）表达载体构建截短B2L重组表达质粒，获得了可溶性ORFV B2L蛋白，为将来建立间接ELISA检测ORFV抗体提供了物质基础，更为准确诊断ORF和流行病学调查提供了简便快捷的方法[6-7]。

为了提高B2L重组蛋白的产量，在试验中通过对B2L基因优化及截短，可以使蛋白得到更好的表达，且不失B2L蛋白的免疫原性。又通过表达条件的摸索和优化，使用最佳条件，37 ℃ IPTG终浓度1 mmol/L，诱导表达3 h，最终蛋白得到了大量表达。