母牛妊娠诊断方法概述

高能华

(甘肃省平凉市崆峒区畜牧技术服务中心，甘肃 平凉 744000)

目前我国养牛业情期受孕率低，易造成发情母牛失配和妊娠母牛误配，从而延长产犊时间，降低繁殖效率。因此母牛配种(或授精)后不久，需要进行妊娠诊断，以便加强怀孕母牛饲养管理，保证顺利分娩。对空怀母牛及时补配，缩短产仔间隔，降低繁殖损失。常见母牛妊娠诊断方法有以下几种：

1 直肠检查

检查者将手伸入母牛直肠内，隔着直肠壁用手触摸和感受卵巢上有无黄体、子宫变化、子宫颈变化、怀孕动脉有无、子宫位置、胎儿等情况来判断是否怀孕，效果取决于检查者的临床经验、母牛和胎儿的发育状况等。一般情况下在配种50 d以后才能进行妊娠诊断。直肠检查是长期以来简便而有效的母牛妊娠诊断方法，只要技术熟练，操作得法，对孕牛和胎儿没有什么影响。但须经过训练实践才能正确掌握技术，而且不卫生，劳动强度大，寒冷天气操作不便，长期操作易患关节炎，检查时疏忽大意和技术不熟练，会导致母牛直肠破裂或流产，早期诊断较困难。国外认为准确性只有70%。

2 超声波诊断法

是把超声波的物理特点和动物组织结构的声学特点密切结合的一种物理学诊断法，以高频声波对母牛子宫进行探查，将回波放大后转化成不同信号显示出来进行妊娠诊断。国内从上世纪80年代开始研制各类超声波诊断仪进行母牛妊娠诊断研究。A型超声波分为示波式和报警式两种，示波式A型超声波探查子宫，显示妊娠波型就可提示妊娠。报警式A型超声仪听到仪器发出连续的“嘟嘟”声时可判定为怀孕，若发出断续的“嘟、嘟”声，经多次调整探头方向仍无连续的响声，则判定为未孕，对配种后21～45 d母牛妊娠和空怀的符合率分别为98.04%和72.73%。B型超声波根据扫描时在荧光屏上显示的含胎水的子宫、胎体切面图象诊断妊娠，效果比A型和D型仪清晰准确，近年来开始在母牛妊娠诊断上应用，诊断最佳时间为配种后36～45 d，诊断准确率为100%，可疑牛只可在46～60 d进行复检确认。D型超声波诊断法又称超声多普勒探查法，可在母牛怀孕早、中、后期从阴道和直肠探查，根据探到宫血音、胎心音和胎血音等各种特征性多普勒信号，判断为妊娠，否则未孕。配种后20～30 d、31～60 d妊娠符合率分别为71.7%～97.91%、93.8%～100%，未怀孕母牛准确率为96.1%～100%。超声波诊断法操作简便，容易掌握，省时省力，准确率高，尤其B超以实时图像显示，具有客观性，是一种良好的早期妊娠诊断法，可以取代直肠检查。

3 血小板计数法

母畜怀孕后的受精卵，特别是桑椹胚将产生一类乙酰化的甘油磷脂——血小板活化因子(PAF)。PAF将引起不依赖于ADP释放和产生四烯酸代谢的血小板凝集，特别是胚胎性PAF能够介导妊娠母体对胚胎的识别，而引起母体妊娠的最初反应——血小板减少。试验发现母牛发情配种后血小板值逐日下降，第7 d降到最低点，以后又将逐日上升，恢复到配种前的水平。根据PAF可能引起母畜血小板数值减少这一现象，即可对母畜配种后数小时至数天内是否妊娠作出判断。以母牛配种前后血小板值差>192.3×109/L为标准，诊断妊娠母牛符合率为80.67%～86.36%，空怀母牛符合率为85.71%～89.87%。诊断母牛早期妊娠具有时间早、方法简单，易学易用，准确率高等优点，值得推广应用。

4 硫酸铜法

Koch(1983)报道，母牛受孕后不久，乳和血清中会出现一种妊娠依赖性多分子蛋白质复合物——早孕因子(EPF)，它的出现和持续存在能够特异性地代表受精和孕体发育，所以是早期妊娠诊断的一项重要指标。硫酸根可使早孕因子发生凝集，用来定性分析乳中早孕因子含量，从而达到早期妊娠诊断的目的。取常乳和末把乳各1 mL于玻璃平皿中，滴入1～3滴3%硫酸铜溶液并迅速混合均匀，呈现云雾状沉淀者为妊娠，反之为未孕。配种后20～30 d内为最佳检乳时期，以中午乳汁检查与直检对照的符合率最高，每头奶牛采常乳和末把乳同时检测准确率较高，妊娠符合率为70%～91.8%，未妊娠符合率为63.6%～87.50%。硫酸铜法对牛早期妊娠诊断符合率较高，操作简便、检测快速，药品来源广泛，适合牛舍现场操作，可作为一种早期妊娠诊断的常规方法应用，但仅适用于经产母牛，而对于青年怀孕牛无法进行早期检查。

5 血清酸滴定法

妊娠母牛在胚胎快速生长的过程中，机体产生一种特有的免疫球蛋白，在酸性环境中具有与其它蛋白质形成低溶性复合物(絮状物)特性，据此可以对母牛进行早期妊娠诊断。方法是采取配种后16～45 d的母牛血清0.5 mL于小烧杯中，加入0.2M盐酸7.5 mL，用磁力搅拌器混合1～2 min ，再用13%硝酸滴定至pH 0.68，滴定时间不少于5 min，然后将此溶液立即倒入试管内静置20 min，在透射光下观察反应，呈乳白色絮状物或乳黄色絮状物者为妊娠，呈乳白色或无色透明者为未妊娠。用血清酸滴定法诊断配种后16～45 d的不同品种母牛，妊娠符合率88.46%～97.48%，空怀牛符合率 为84.13%～95.24%。血清酸滴定法具有诊断时间早，采样时间范围较宽，方法简单，结果准确，设备廉价，易操作判定，适合基层单位生产实践中应用。但早期胚胎死亡影响诊断的准确率。

6 放射免疫测定法

放射免疫测定法(RIA)是一种将同位素的放射测量与免疫反应原理相结合的微量分析方法。研究表明，乳中孕酮(P4)浓度与血中P4浓度平行，怀孕奶牛乳汁P4含量与发情期奶牛乳汁P4含量差异显著，因此根据乳中或血浆中P4浓度测定结果，可以进行早期妊娠诊断。血浆中P4测定通常在授精后17～24 d采血1 mL/(头·次)，离心后加入防腐剂，冷冻保存24 h后进行测定，P4≥2.0ng/mL判为妊娠，准确率为80%～100%，低于1.0 ng/mL时，诊断为未妊娠的准确率为53%～88.0%。乳样中P4测定通常在授精后21～24 d采取下午乳汁，加入防腐剂后于4℃保存，以乳汁P4小于8 ng/mL为不孕，大于11 ng/mL为妊娠，其间为可疑，妊娠确诊率为80.7%～92.3%，未孕确诊率为87.7%～100%。草原红牛、西门塔尔牛授精后21 d血清中P4大于2.5 ng/mL判定已孕，延边黄牛授精后21 d血清中P4大于4.0 ng/mL判定已孕。由于乳汁中P4含量比血液中高，采样比较方便，所以实际工作中常采用测定乳汁P4含量判定是否妊娠。RIA法诊断奶牛早期妊娠精确度和灵敏度高，早孕诊断迅速，但因设备昂贵，技术要求高，操作费时且存在放射性危害等，从而限制了该技术的普及。浙江大学开发的“奶牛早妊、生殖疾病通讯奶样放免分析”技术，生产单位用一定大小的纸片分别蘸取配种后19、23 d奶牛乳汁，自然干燥后寄送实验室，用RIA法测定P4进行早孕诊断，妊娠、未妊娠和难孕诊断准确率分别为95.1%、85.8%和96%。采样方法简单，样品寄递方便，配后30 d左右可得到诊断结果，具有实用、简便和易推广优点。

7 酶免疫测定法

测定奶牛发情周期中P4浓度变化，发现配种后19～24 d，孕牛奶P4含量极显著高于非孕牛，可用于奶牛早孕诊断。酶免疫测定法(EIA)是用酶标记孕酮，根据肉眼观察酶作用于底物产生颜色反应的深浅进行定性试验，通过颜色反应测定奶P4浓度高或低，奶P4浓度高的被认为是妊娠母牛，浓度低的是未妊娠母牛。也可通过分光光度计或酶标读数器读取底物液的光密度值，计算P4浓度进行定量诊断。EIA法中主要以酶联免疫吸附测定法(ELISA)常见。定性试验判断配种后19～23 d孕牛准确率为78%～83%，未孕牛准确率为95%～96%。定量诊断对配种后第20～22 d奶牛连续采样，乳汁P4含量皆大于3 ng/mL者为妊娠，连续2次小于3 ng/mL者为空怀，间或有1次小于3 ng/mL者为可疑，诊断为妊娠和空怀准确率分别为92%和97%，可疑率为4%。也有以配种后21 d全奶P4含量(p)≥5.00 ng/mL，≤2.70 ng/mL和2.70

此外还有妊娠相关糖蛋白检测试剂盒、早孕因子诊断法、荧光定量PCR技术法、胶体金免疫层析试纸条、乳胶凝集抑制试验、宫颈—阴道粘液电导率测定法、眼球结膜血管象变化法等方法，通过测定配种后母牛血清中妊娠相关糖蛋白(PAG)、早孕因子(EPF)、干扰素刺激基因(ISG15、RSAD2)、乳汁中P4、尿液中类绒毛膜促性腺激素(类hCG)、子宫颈粘液电导率(CVME)、观察母牛眼球结膜血管象变化等，进行母牛妊娠诊断。

综上所述，母牛妊娠诊断方法各有优缺点，有待进一步验证和改进，使妊娠诊断技术向着早期、快速、准确和生产现场易于操作的方向发展，建立一种理想、高效的妊娠诊断方法，推动养牛业的健康迅速发展。