孕牛血清中早孕因子的分离纯化与鉴定

王晓姗，陈树林，张文华，张宏刚

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100)

早孕因子( early pregnancy factor，EPF)是1974年由澳大利亚学者Morton等[1]在孕鼠血清中首次发现，认为EPF与妊娠相关。近年来，人们逐渐证实，EPF是由受精卵及胚胎组织分泌的具有免疫抑制及生长调节作用的分泌蛋白质[2，3]，是妊娠早期母体乳汁中最早出现的一种免疫抑制因子，从受精开始到妊娠中期， EPF在人类及家畜母体内都会发挥作用，并出现生物活性的变化，在胚胎死亡或胚胎采出后24 h～48 h内，EPF即消失。EPF可以用于预测早期胚胎死亡与流产、鉴定胚胎移植效果、监测胎儿的状态以及食道癌诊断[4，5]。

1 材料和方法

1.1 血清来源

血清样本取自受孕4～5个月的孕牛血，经3 000 r/ min离心后，取上清，56 ℃、30 min灭活，20 moL/L PBS A (pH 8.0) 4℃ 透析过夜。

1.2 试剂

DEAE-Sepharos F. F，CM-Sepharose F.F，Con A-Sepharose 4B，Heparin Sepharose Cl 6B均够自Pharmacia。

1.3 EPF活性检测[6]用玫瑰花环抑制实验(Ea-RIT法)

本实验以RIT≥8为EPF阳性，RIT<8为EPF阴性。

1.4 早孕因子( EPE)分离与纯化

其分离纯化参考Mehta等[7]的方法，并加以改进。将20 moL/L PBS A 透析24 h的孕血清加于DEAE-Sepharose F.F离子交换层析柱上，收集DE-1，置于50 moL/L乙酸铵缓冲液(pH 5.0)中4 ℃透析过夜。将透析的DE-1上样 CM-Sepharose F.F离子交换层析，收集透过峰CM-2，0.1 moL/L醋酸盐缓冲液(PBS B) 4℃ 透析24 h。将透析的CM-2上样 ConA Sepharose 4B 亲和层析 ，得到透过峰ConA-1，将活性峰 ConA-1浓缩后，置于含0.1 moL/L KCL，pH 7.0，0.05 moL/L Tris-HCL缓冲液(PBS C)4℃透析24 h。将透析的ConA-1上样Heparin Sepharose CL 6B亲和层析，收集HE-2 峰。将活性峰HE-2用 PEG 20000浓缩，用去离子水4℃ 透析24 h，冻干保存。

1.5 蛋白含量测定[8]用Lowry 法。

1.6 纯化结果用SDS-PAGE电泳法[9]鉴定纯化结果。

2 结果与分析

2.1 孕牛血清中 EPF 的纯化结果

孕牛血清通过DEAE-Sepharose F. F离子交换层析出现两个峰，经Ea-RIT检测DE-1有EPF活性,DE-1通过CM-Sepharose F.F离子交换层析出现三个峰，经Ea-RIT检测CM -2有EPF活性，CM-2通过ConA Sepharose 4B亲和层析出现两个峰，经Ea-RIT检测ConA-1有EPF活性。ConA-1通过Heparin Sepharose CL 6B亲和层析出现两个峰，经Ea-RIT检测HE-2有EPF活性。

2.2 孕牛血清中 EPF 蛋白含量分析

将怀孕4～5月的孕牛血清通过离子交换层析和亲和层析蛋白分离纯化技术后，对蛋白质浓度、含量和回收率进行了分析，同时采用玫瑰花环抑制实验对收集到的蛋白质生物活性进行了检测，其结果如表1所示。

表1 孕牛血清中 EPF 蛋白含量分析

2.3 SDS-PAGE电泳结果

将收集到的HE-2通过SDS-图1：SDS-PAGE鉴定纯化产物

图1 PAGE进行分析鉴定分离纯化结果

3 讨论

本实验的目的是从孕牛血中分离纯化EPF，为制备EPF单克隆抗体做准备。将孕牛血清通过DEAE-Sepharos F. F 离子交换层析、CM-Sepharose F.F离子交换层析、ConA Sepharose 4B 亲和层析、Heparin Sepharose CL 6B亲和层析，所得各阶段物质采用玫瑰花环抑制实验检测[10]，结果表明第一次过DEAE-Sepharos F. F离子交换柱时,不吸附在离子胶上的蛋白DE-1具有EPF活性，而吸附的蛋白DE-2没有EPF活性；过CM-Sepharose F.F离子交换柱时，用50 moL/L乙酸铵缓冲液洗下来的蛋白CM-1没有EPF活性，用 50 moL/L NaCl 的相同乙酸铵缓冲液洗下来的蛋白CM-2有EPF活性，而用 1 moL/L NaCl的相同乙酸铵缓冲液洗脱下来的蛋白 CM-3 也没有EPF活性，在离子交换反应中,EPF不吸附在DEAE-Sepharos F. F离子交换胶上，EPF而吸附CM-Sepharose F.F离子交换胶上。过ConA Sepharose 4B亲和层析柱时，不能与ConA Sepharose 4B 亲和的蛋白ConA-1有EPF活性，能与ConA Sepharose 4B亲和的蛋白ConA-2没有EPF活性。过Heparin Sepharose CL 6B亲和层析柱时，不能与Heparin Sepharose CL 6B亲和的蛋白HE-1没有EPF活性，能与Heparin Sepharose CL 6B亲和的蛋白HE-2具有EPF活性[11,12]。在亲和层析过程中，由于在孕血清中存在许多种妊娠相关蛋白和激素，其中很多为糖蛋白，如α-甲胎蛋白、绒毛膜促性腺激素( HCG)、妊娠相关蛋白α-2巨球蛋白等，经过ConA Sepharose 4B层析柱后，将这些糖蛋白[13]除去。经过Heparin Sepharose CL 6B柱后，最后得到纯化的EPF。运用SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳检测，可见蛋白条带，相对分子量为53.6KD。目前我们通过纯化早孕因子(EPF)为免疫小鼠制备早孕因子单克隆抗体，为制备出特异性强和纯度高早孕因子单克隆抗体做准备,为进一步研制牛流产及不孕症快速检测胶体金试纸条提供条件。

参考文献:

[1] Morton H, Hegh V, Clunie G J A. Immunosuppression detected inpregnant mice by the rosette inhibition test [J].Nature,1974,249 (456):459.

[2] Athanasas-Platsis S,Somodevilla-Torres M J,Morton H. Investigation of the immunocompetent cells that bind early pregnancy factor and preliminary studies of the early pregnancy factor target molecule[J].Immunol Cell Biol,2004,82(4):361-9.

[3] Recombinant EPF/chaperonin 10 promotes the survival of O4-positive pro-oilgodendrocytes prepared from neonatal rat brain[J].Cell Stress Chaperones,2008,13 (4):467-74.

[4] 王晓申,魏丽军,叶绍辉.早孕因子研究进展[J].生物技术通讯,2008,19(2):313-316.

[5] Miao-Fen Chen,Kuan-Der Lee,Ming-Shian Lu. The predictive role of E2-EPF ubiquitin carrier protein in esophageal squamous cell carcinoma[J]. J Mol Med (2009) 87:307-320

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[8] 李建武.生物化学实验原理和方法[M].第1版.北京 北京大学出版社,1994,189

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[11] Anita R, Met ha SB,Moodbidri VP. Raghavan et.Isolationand partial characterization of early pregnancy factor (EPF) from human pregnancy serum[J]. Journal of Reproductive Immunology,1986 ,9:247-260.

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