隐球菌检验方法的应用

曹 林， 沈继录

隐球菌是广泛存在于自然界中的一种真菌，其中包括新生隐球菌、格特隐球菌等变种。新生隐球菌可引起条件致病性感染，其感染主要发生在免疫力低下的人群，如AIDS患者、器官移植后患者或长期使用糖皮质激素的患者等。新生隐球菌是一种类酵母样真菌，广泛存在于鸽子的粪便、灰尘中等，可经呼吸道、消化道等途径进入人体引起隐球菌病。新生隐球菌菌体周围有一圈宽厚的荚膜，是其重要的致病物质，有抑制人体内免疫细胞吞噬、促使和诱导动物免疫无应答、降低人体对病原菌抵抗力的作用，而菌体外无荚膜的隐球菌则一般不引起隐球菌病。近年来，隐球菌属的实验室检查方法不断改进完善，除了传统的检查方法包括印度墨汁染色、真菌培养、血培养以及荚膜多糖抗原抗体免疫反应，还开展了特定基因的检测，利用特定基因片段的基因序列可用于鉴定、分型和种群遗传学研究。特定的基因组区域，通过PCR进行扩增测序，对非常见的隐球菌引起的隐球菌病的诊断分型尤其重要。

1 常规病原体检查和生化检查

1.1 墨汁染色法

取新鲜标本（如脑脊液）少许，置于载玻片上，滴加印度墨汁或优质国产墨汁并覆以盖玻片，显微镜暗视野下找见圆球形菌体，菌体周围有一圈透明的肥厚荚膜，折光性强，即为阳性，多次查找可提高阳性率。但该法受实验者经验、主观臆断、墨汁质量等影响，阳性率不高，但该法可操作性强，方法简便，仍为实验室检验隐球菌首选方法。

1.2 真菌培养

将新鲜标本接种于沙保弱培养基中，在适宜温度下培养3～4 d可形成肉眼可见的菌落。该法受标本取材、运送过程的影响，培养的阳性率并不高，且操作繁琐，耗时长，易受环境污染，但受目前实验室检验方法限制，真菌培养仍是确诊隐球菌感染的“金标准”。

1.3 生化检查

利用新生隐球菌可产生尿素酶这一特点，常用尿素琼脂培养基培养，尿素酶分解尿素使培养基变为红色。

2 血清学检查

利用乳胶凝集反应检测血清或体液中的荚膜多糖抗原是目前最常用的血清学方法，但试剂检测的敏感度和特异度会因不同标本类型、试剂厂家来源不同而有所差别。

2.1 乳胶凝集试验

以人工合成的聚苯乙烯乳胶颗粒作为载体直接吸附抗体（或抗原）形成致敏乳胶颗粒，可与特异性抗原（或抗体）发生免疫反应产生肉眼可见的白色沉淀，即为乳胶凝集反应。美国IMMY公司进口原装真菌检测系统，可对隐球菌的荚膜多糖抗原进行定量或半定量检测，此法可检测血清、脑脊液及其他体液标本中新生隐球菌荚膜多糖（抗原），可运用于快速诊断[1-2]。在隐球菌感染的早期快速诊断中，乳胶凝集法明显优于墨汁染色和标本真菌培养，且阳性率高，有利于早期发现感染者，防止漏诊。

2.2 胶体金方法

隐球菌荚膜多糖抗原胶体金法试纸条是一种快速和简便的检测试剂，该法利用免疫层析技术，用胶体金标记单克隆抗体，检测特异性隐球菌抗原。若待测标本中存在隐球菌荚膜多糖抗体，则抗原抗体结合，并可在试纸表面迁移层析，检测线和质控线均显红色，则为阳性。据有关文献指出，胶体金法检测结果与乳胶凝集试验和酶联免疫法有很好的一致性，甚至可以检出有Cgattii引起的感染[3]。胶体金法检测隐球菌方法简单，设备要求低，大多数实验室都可开展，因此近年来采用胶体金方法检测隐球菌感染的诊断逐渐得到推广，值得注意的是有文献指出胶体金法的灵敏度为73.17%，存在一定程度的假阴性，因此该法通常作为隐球菌病的初筛方法，阴性结果亦不能排除隐球菌感染。相对于乳胶凝集法，胶体金法检测隐球菌最大的优势在于操作简单，检测时间短，结果判定简单，未来胶体金法可能会取代乳胶凝集法检测新生隐球菌[1-2]。

2.3 酶联免疫法

酶联免疫吸附测定法，是将抗原、抗体等成分以各类标志物标记之，使抗原抗体反应更为敏感而成为肉眼可检测的方法。该法是将已知特异性抗体吸附于聚氯乙烯板孔内，加入待检的含有相应抗原的标本，温育后抗原抗体结合，再加入酶标特异性抗体，如能结合，最后加入适当基质使酶分解，从酶分解后出现的颜色反应可计算出待检标本的抗原含量。新生隐球菌荚膜主要成分为多糖，其中最重要的是葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖（GXM）。研究表明，GXM是隐球菌荚膜多糖最主要的组成部分，约占荚膜多糖总质量的90%，在新生隐球菌的A、B、C、D血清型中都可以检测到，利用双抗体夹心法，其靶抗原为新生隐球菌的GXM，可用于检测新生隐球菌[4]。Percival等[5]通过酶联免疫吸附测定法检测新生隐球菌荚膜多糖的主要成分GXM，设计出单克隆抗体满足多糖抗原GXM 4种血清型的隐球菌抗原检测。

2.4 侧向层析方法

一种新型检测方式，借助于杂化传感技术，可在数分钟内完成对核糖体核糖核酸（rRNA）的检测，侧向层析检测的目的是获得一条清晰分明的检测线，这极大依赖于捕获试剂与硝酸纤维素膜的准确结合。Hansen等[6]通过侧向层析方法、酶联免疫法和乳胶凝集试验 3种方法检测血清、脑脊液中的隐球菌，定性分析结果的一致性为97.7%，表现出较好的一致性。McMullan等[7]利用侧向层析方法和乳胶凝集试验方法检测隐球菌的结果也达到较好的一致性，但侧向层析方法/酶联免疫法的效价却不理想。Williams等[8]通过侧向层析方法检测指尖血清、血浆、全血的隐球菌抗原，结果一致可靠，表明可用于患者隐球菌病的筛查和方便临床工作。

3 组织病理学检查

隐球菌在机体内大量繁殖后可引起机体免疫反应，发生慢性炎性反应，病变早期产生的大量荚膜物质具有抑制中性粒细胞趋化作用和吞噬作用，故浸润的炎性细胞是单核细胞、淋巴细胞和浆细胞。有的病变则表现为肉芽的形成，主要由单核细胞、上皮细胞和多核巨细胞等构成，此时隐球菌数目较少，且大部分被吞噬细胞吞入胞浆内。在新鲜的活动性病灶内，菌体大小不等，小的居多，大多处于出芽状态，容易见到单芽生孢子。

3.1Masson-Fontana银染色方法

Masson-Fontana黑色素染色利用黑色素具有将银氨溶液还原为金属银特性即嗜银反应原理来显示黑色素，染色后黑色素呈黑色，该法属于常用的黑色素特殊染色法，效果较其他染色理想。其缺点是浸银时间太长，银易析出，不易掌握。该法易受操作人员经验水平限制，若染色时间掌握不当，易出现过染现象。Bishop等[9]的Masson-Fontana银染试验对隐球菌的灵敏度为100%，但出现了假阳性，敏感性和阴性预测值高，特异性较低。

3.2 瑞氏-姬姆萨染色

取脑脊液0.5 mL，采用粟式FMU-6玻片离心沉淀法收集细胞，运用细胞学瑞氏-姬姆萨染色，在高倍镜下可直接观察到隐球菌形态呈大小不等、相隔距离基本相同的紫蓝色圆形茁体[10]。

3.3 麦胚凝集素染色

通过异硫氰酸荧光素结合凝集素，评估伴刀豆球蛋白A、荆豆凝集素、麦胚凝集素、花生凝集素对临床分离株新生隐球菌变种（Cryptococcus neoformans var. Grubii）的细胞壁染色效果，发现麦胚凝集素染色的效果最好，提示可用于疑似隐球菌感染检测[11]。

3.4 其他

HE染色的切片上，新生隐球菌着色较浅，菌体结构不清难以观察，胞壁淡蓝色或淡红色，荚膜不着色；过碘酸雪夫（PAS）染色和六胺银（GMS）染色主要是利用荚膜多糖对染料具有强亲和力，PAS染色菌体呈淡红色；GMS染色呈黑色。

4 分子生物学方法

分子生物学方法并不是隐球菌病的常规诊断方法，但因其具有高灵敏度和高特异度，可以克服传统诊断的各种缺陷，因此在菌种鉴定、分型、分子流行病学方面应用广泛。利用分子生物学方法，针对不同隐球菌种的特定基因序列检测，可对临床标本或培养物中的隐球菌进行检测和分型。其中最主要的就是杂交技术，杂交技术是分子鉴定和针对病原体检测的特异性分子探针的基础。

4.1DNA–DNA分子杂交

该方法理论基础是通过碱基互补配对形成稳定的杂合双链DNA分子。DNA–DNA杂交的特异性探针的发展，为隐球菌病的病原种类的先驱研究做出了铺垫，特别是Southern印迹杂交，经琼脂糖凝胶电泳分离后检测特定的DNA片段的分子含量，可作为对新生隐球菌和格特隐球菌特定区域初始识别的一种主要方法。随着其他更加快速有效技术的出现，DNA–DNA分子杂交更多的用于科研。目前Luminex xMAP分子技术用到的原理主要是杂交，通过Luminex xMAP特异性的内转录间隔区（ITS）-2探针同时检测临床相关真菌，包括隐球菌。有学者通过rDNA IGS的探针对神经隐球菌病的患者脑脊液标本和培养物进行分子杂交，成功分离出病原菌。

4.2 聚合酶链反应（PCR）

真核生物的rRNA基因ITS是rDNA上的一个非编码区域，它包括ITS-1（位于18S rDNA和5.8S rDNA之间）和ITS-2（位于5.8S rDNA和28S rDNA之间）区。该区域受外界环境的影响较小，与编码区相比具有进化速度快的特点。因此ITS是常被用来PCR扩增的基因序列，可分析检测隐球菌[12]。PCR是隐球菌病病原体研究的主要分子技术。Feng等[13]使用一对引物通过单重PCR对特定糖转运蛋白基因扩增，可快速鉴别和区分隐球菌。

4.3PCR-限制性酶切分析

基因组或一段核酸用限制性内切酶消化产生的片段经电泳等方法分离形成独特的条带图谱，对DNA序列的特征进行分析。Cordeiro等[14]通过PCR-限制性酶切分析检测隐球菌CAP59基因发现，与通过形态和生化特征鉴定的手工方法相比，PCR-限制性酶切分析表现更加高效、快捷，且检测结果与手工法结果一致。

4.4 巢式PCR

巢式PCR是一种变异的PCR，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段，是一种有效而特异性高的分子技术。Putignani等[15]首次使用巢式PCR检测患者脑脊液标本中的隐球菌rDNA的ITS，发现具有高灵敏度，真菌细胞为10个/mL就可检出，标本检出率100%。虽然比传统PCR灵敏度高，但也要注意非特性产物的干扰。

4.5 多重PCR

多重PCR是在普通PCR的基础上加以改进，于一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。Zhou等[16]通过与瑞氏-姬姆萨染色相比，多重PCR技术检测隐球菌脑膜炎患者标本，其敏感度和特异度分别为92%和97.1%，Rhein等[17]的检测灵敏度和特异度均为100%。多重PCR Luminex技术可同时检测多种病原体，也表现出潜在的高效率。与常规PCR相比，多重PCR存在多态性以及引物竞争目标序列和反应物等缺点。

4.6 实时荧光定量PCR

利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线进行定量分析的方法，成为实验室快速诊断方法，已广泛应用于真菌性疾病的诊断，目前也逐渐应用于隐球菌感染的诊断。利用TaqMan探针法荧光定量PCR检测新生隐球菌基因组DNA，具有良好的敏感性、特异性、重复性，可早期准确地诊断隐球菌性脑膜炎，为临床诊断和治疗提供重要依据[18-19]。

4.7 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）

MALDI-TOF MS 是一门新兴的分子成像技术，对于发现疾病生物学标志和研究药物代谢等方面具有重要意义，并具有良好的临床应用前景。这种技术可以在数分钟内鉴定，且能完成菌体多种成分的分析，包括蛋白质、脂类、脂多糖和脂寡糖、DNA、多肽及其他能被离子化的分子。对于隐球菌的分类，传统的方法是通过菌体的外部形态特征、生化生理特征，但敏感性和特异性差，结果准确度不高。MALDI-TOF MS可作为隐球菌属中菌株分类鉴别中有效的分子生物学方法[20]，能可靠地揭示隐球菌属中各菌种的种间及种内的遗传进化关系，MALDI-TOF-MS比多位点序列分型（MLST）更为快捷准确[21]。2012年Piractive等[22]利用质谱技术对164株新生隐球菌和格特隐球菌进行鉴定，可以100%鉴定到种，并对8个主要的分子类型进行分类。Tarumoto 等[23]认为MALDI-TOF MS对鉴别播散性隐球菌病是非常有用的手段，他们收集了过去10年医院发生传播性隐球菌病8例患者的标本，通过使用MALDI-TOF MS和基因测序方法对比检测，结果MALDI-TOF MS可准确检测出全部8例隐球菌，而基因测序法将其中的1株鉴定为曲霉。

4.8Luminex xTAG

此技术使用Luminex专有的通用标签，通过标签序列与反标签序列的专一性互补配对，进行核酸实验优化，产品开发和分子诊断化验。xTAG技术能保证相同的复性温度和杂交效率，且有效避免不同检测物标记的微球之间交叉杂交。Baladaliasat等[24]利用xTAG技术检测血培养的临床真菌（包括隐球菌），显示其灵敏度和特异度分别高达100%和99%。

5 小结

关于微生物的分型，下述方法可用来区分真菌的血清型和分子分型，如PCR指纹图谱，PCR-限制性片段长度多态分析技术、扩增片段长度多态性和多位点序列分型[25]。通过分子生物学方法，可对耐药菌株的监测和疾病的治疗产生积极影响。虽然隐球菌的检测方法有很多，但快速准确、敏感性高、特异性好的抗原检测技术和分子鉴定技术的要求较高，需要相应的设备和技术人员以及费用较高等问题，多用于科研，临床应用少；而目前临床应用的墨汁染色法、真菌培养等检测方法阳性率不高、耗时，但成本较低。因此需要解决这方面的问题，有待进一步探索出快捷、方便、准确、费用低的检测方法。

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