运动调控骨代谢的关键膜上受体—G蛋白偶联受体48

陈祥和 杨康 赵仁清 孙开宏 蔡先锋

1. 扬州大学体育学院，江苏 扬州 225127 2. 扬州职业大学体育学院，江苏 扬州 225127 3. 淮阴工学院体育教学部，江苏 淮安 223001

G蛋白偶联受体48(G protein coupled receptor 48, GPR48/LGR4)作为膜上的七次跨膜受体，其LRR结构域通过与配体R-spondin1(Rspo1)FU-CBD位点或Norrin作用发挥多级生物学效能[1]。当敲除GPR48后，肾脏形态、生殖细胞(精子)形成、能量代谢、红细胞生成等发生紊乱。且GPR48基因敲除后的低表达，使得成骨细胞(osteoblast, OB)分化、成熟及其骨形成能力被抑制而破骨细胞(osteoclast, OC)分化、融核及骨吸收能力显著升高，骨生长发育被显著抑制，导致骨质疏松及骨折发生[2-3]。Wnt、环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)/蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)/ATF4、骨保护素(osteoprotegerin, OPG)/核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand, RANKL)/核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor κB, RANK)等是运动训练影响骨组织代谢的关键信号途径。并且，研究证实GPR48与以上信号途径的级联反应，调控多种生物学效能[4]。运动可显著改善骨代谢，8周下坡跑上调GPR48表达后抑制2型糖尿病(type 2 diabetic melitus, T2DM)小鼠OC分化，改善骨代谢[5]。综上，既然运动通过调控GPR48或相关信号途径可改善骨代谢，且GPR48与Wnt、cAMP/PKA/ATF4和OPG/RANKL/RANK等信号途径存在密切调控关系。那么，运动改善骨代谢是否通过GPR48及其介导的下游信号途径进行调控呢？基于此问题，本研究将对GPR48在运动调控骨代谢中的作用及分子机制进行综述，为运动调控骨代谢的分子机制信号网络做一重要补充。

1 GPR48生物学作用

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPRs或LGRs)是具有多种功能的膜上受体，可识别来自神经、激素和旁分泌器官等特异性配体，通过配体(Rspo1、Norrin等)-受体(即富亮氨酸的大量细胞外N端结构域)之间的相互调控来作用于胞内G蛋白(α亚基)引起相应的级联反应，调控细胞生长、增殖和分化。GPCRs扩展家族包含三类糖蛋白受体家族：①LGR1、LGR2和LGR3；②LGR7和LGR9；③LGR4(GPR48)、LGR5和LGR6。其中，GPR48在骨骼、生殖、泌尿等组织器官大量表达[6]。从最初发现GPR48作为一膜上孤儿受体，到后来证实其配体Rspo1、Rspo3和Norrin，Rspo1、Rspo3和Norrin等可通过静电和疏水之间的相互作用，使其分子的平坦β折叠架构GPR48表面凹面(即一扭曲的马蹄状结构)相结合[7]，通过G蛋白介导来调控多条信号途径，从而在生殖系统发育及生殖细胞形成、骨骼肌能量代谢、癌细胞增殖、先天免疫应答、阿尔茨海默病等多生物学过程中发挥不可或缺的调控作用[8]，并且，GPR48在骨生长发育、骨形成和骨吸收代谢过程中亦扮演重要角色。GPR48基因缺失导致小鼠骨形成降低且骨吸收显著增强，骨生长发育被显著抑制[2]。且人体研究发现，该基因发生突变使得机体股骨颈和第五腰椎骨量下降且伴有常发性的骨质疏松甚至骨折等症状[3]。

适宜运动作为影响骨代谢的重要干预手段，其通过促进骨形成并抑制骨吸收来改善骨代谢的作用已被很多研究所证实并广为认可。研究发现，Wnt、cAMP/PKA/环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)、转换生长因子β(transforming growth factor β, TGF-β)/骨形成蛋白(bone morphogenic protein, BMPs)、OPG/RANKL/RANK等关键信号途径是介导骨形成或骨吸收代谢的重要调控媒介[9]。GPR48与以上调控骨代谢关键途径之间的相互协同或拮抗是多种生理学作用发挥的关键分子调控机制。并且，骨作为力学刺激敏感组织，运动通过以上信号途径或关键分子的调控作用，可显著改善骨新陈代谢[10]。研究证实，运动亦可显著上调骨中GPR48表达进而改善骨代谢[11]。近年来，随着细胞分子信号调控理论的逐渐丰富与完善，以往的初浅认识已不能充分揭示运动影响骨代谢的分子调控机制。GPR48与介导骨代谢关键信号途径相互之间的信号偶联机制可能是探究运动改善骨代谢分子机制的新思路或新靶向。

2 GPR48在运动调控骨代谢中的作用及机制

2.1 GPR48在运动调控骨形成代谢中的作用机制

2.1.1Wnt信号通路：Wnt信号通路分为β-catenin介导的经典通路和Ca2+、平面细胞极性(planar cell polarity，PCP)分别介导的非经典通路。经典Wnt信号途径通过非磷酸化后的β-catenin入核并与T细胞因子(T-cell factor，TCF)/淋巴增强结合因子(lymph enhanced binding factor，Lef)形成一转录复合基团来调节靶基因(如细胞周期蛋白(cyclinD1)、轴抑制蛋白2(axin inhibition protein 2, Axin2)、C-myc和过氧化物酶增殖激活受体δ(peroxisome proliferator activates the receptor δ，PPARδ)等)表达，促进骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)向OB分化[12]。GPR48可调控骨形成代谢，但有关其调控Wnt/β-catenin信号途径从而发挥相应生物学作用的研究目前集中在肿瘤迁移、细胞增殖等方面。近来有研究发现，GPR48激活Wnt/β-catenin信号途径后, β-catenin转位入核并调控Runx2等靶基因，促进从关节炎患者胫骨平台下软骨板中获得的OB分化及其骨形成能力[13]。适宜运动(尤指可对骨产生直接作用力的运动方式，如下坡跑、跳跃运动等)不仅可上调骨中GPR48表达[11]，亦可通过激活Wnt/β-catenin来上调靶基因c-Myc、Cyclin D1等表达，促进BMSCs向OB分化并抑制向脂肪细胞和软骨细胞分化，提高骨形成能力增和骨密度(bone mineral density, BMD)[14]。但有关GPR48通过Wnt/β-catenin途径介导运动促进OB分化和骨形成的相关研究较少。Shi等[15]在研究力学刺激促进MC3T3-E1向OB分化及其骨形成能力时，发现GPR48与其配体R-Spondin1结合后发生磷酸化，进而激活Wnt/β-catenin信号途径。GPR48亦可作用于其另一配体Norrin的N端结构域，促进G蛋白α亚基分离并活化，使得Wnt并下游β-catenin活化。表明，力学刺激促进R-Spondin1和Norrin与GPR48结合并上调其表达，可激活Wnt/β-catenin途径，促进OB分化及骨形成。体内研究中，OB作为力学刺激敏感细胞，运动训练促进骨形成的机制与其对骨产生的力学刺激上调GPR48及Wnt/β-catenin途径密切相关。非经典Wnt信号通路(Wnt/Ca2+和Wnt/PCP通路)分别依靠Ca2+和Dishevelled蛋白(dishevelled protein, Dvl)在背腹侧发育、细胞迁移等以及骨形成代谢、运动性和分裂等过程中均发挥重要调控作用[16]。骨代谢研究中，非经典Wnt途径可通过钙调蛋白激酶Ⅱ(calmodulin kinaseⅡ, CaMKⅡ)- 转化生长因子激酶1(transforming growth factor kinase 1, TAK1)-TAK1结合蛋白2(TAK1 binding protein 2, TAB2) -Nemo样蛋白激酶(nemo-like kinase, NLK)转录抑制PPARγ蛋白磷酸化，上调Runx2表达，促进BMSCs向OB分化、成熟和骨形成。亦可通过下调RANKL表达，使得RANK失活，抑制OC分化产生及骨吸收代谢[17]。作为GPR48配体的R-Spondins1，通过其Furin结构域与GPR48的C端LRR结构域结合并将其激活，调控下游Wnt/PCP途径在胚胎形成、干细胞增殖等生物学过程中的作用发挥[18]。有研究证实，GPR48通过激活Wnt/PCP而不是Wnt/Ca2+信号途径，可显著促进C57BL/6小鼠BMSCs向OB分化并提高其骨形成能力[13]。在研究Wnt非经典途径在运动训练促进生长期小鼠骨生长发育时，发现在此过程中Wnt/PCP途径的Wnt5a及其下游Ror2、卷曲蛋白受体4(frizzled receptor 4, Frz4)和低密度脂蛋白受体5(low density lipoprotein receptor 5, LRP5)等靶基因表达显著上调，而Wnt/Ca2+途径中相关因子表达变化不显著[19]。以上研究表明，运动促进骨形成的分子机制与Wnt/PCP途径激活密切相关，而Wnt/Ca2+途径在此过程中调控作用不显著。GPR48通过激活Wnt信号途径(β-catenin和PCP途径)及下游靶基因c-Myc、LRP5等表达，介导运动训练促进OB分化、成熟及骨形成代谢的生物学过程。

2.1.2cAMP、CREB和ATF4：cAMP作为胞内重要第二信使，在Ca2+和Mg2+作用下，胞内ATP转化为cAMP，进而激活下游PKA，并在CREBSer133位点将其磷酸化，活化的CREB通过激活ATF4并进而作用于下游Runx2、Col1等靶基因表达，促进BMSCs向OB分化及骨形成[10]。骨形成调控过程中，GPR48与cAMP/CREB/ATF4途径存在协同作用，且该途径是调控骨生长发育的重要信号转导通路。Luo等[2]研究证实，敲除GPR48后，骨中cAMP表达下调，PKA和CREB去磷酸化，使得ATF4蛋白及其靶基因Cyclin D1表达下调，OB分化及骨形成能力降低，骨钙蛋白(osteocalcin, OCN)、Ⅰ型胶原蛋白等分泌减少，骨量下降，小鼠骨生长发育被抑制。体外研究亦发现，cAMP在机械力学刺激促进OB分化和骨形成能力过程中具有重要介导作用[20]。力学刺激通过上调cAMP表达，使得CREB在Ser133位点上磷酸化，进而激活ATF4，促进MC3T3-E1向OB分化[21]。体内研究中，9周跑台训练激活C57BL/6小鼠骨中cAMP/CREB/ATF4途径及其靶基因Runx2、骨钙素、骨涎蛋白(bone sialoprotein, BSP)等表达，促进BMSCs向OB分化并提高其骨形成能力，改善骨组织形态结构[22]。分析以上研究，发现cAMP/CREB/ATF4途径激活是运动促进OB分化产生及其骨形成能力，进而改善骨代谢的关键信号通路。体育科学领域内，有关GPR48激活cAMP/CREB/ATF4途径介导运动促进骨形成代谢的相关研究尚待揭示。但鉴于GPR48与该信号途径之间的密切调控关系，且运动可显著上调GPR48和cAMP/CREB/ATF4途径中相关因子表达。那么，运动改善骨形成的分子机制与激活GPR48及下游cAMP/CREB/ATF4途径及下游靶基因(Runx2、OCN、BSP等)表达，促进OB分化、成熟及骨形成密切相关。

2.1.3TGF-β和BMPs：TGF-β 和BMPs具有高度同源性，均通过R-Smads(Smad2/3和Smad1/5/8，而Smad4均可与以上两基团结合)磷酸化后形成信号传导基团并转位入核，作用于Smad作用蛋白1(Smad interacting protein 1, SIP1)、TG相互作用因子(TG-interacting factor, TGIF)和p300/CBP相关因子(p300/CBP-associated factor, P/CAF)等转录或翻译，调节细胞增殖、分化、迁移及凋亡[23]。TGF-β在OB中以自分泌方式调节其增殖、分化及代谢。TGF-β/Smads信号途径活化后显著上调Smad7、纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)等靶基因表达，促进人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells, hMSC)向OB分化产生和成熟[24]。并且，TGF-β途径激活促进OB分化产生的分子机制还与Smad2/3磷酸化后上调激活素样激酶5(activin-like kinases5, ALK5)和PKA表达，促进非磷酸化β-catenin转移入核来调控相关靶基因有关。GPR48与TGF-β/Smad途径具有密切调控关系。在研究骨骼肌形成过程中GPR48与TGF-β调控关系时，发现利用Follistatin(Fst)抑制GPR48后，其可通过其配体R-Spondin1下调TGF-β表达[25]。并且，GPR48表达上调可激活TGF-β，促进下游Smad2/3磷酸化及靶基因表达，来调控人类红细胞终末分化[26]。但有研究却发现，当在心肌细胞上特异性敲除GPR48后，TGF-β/Smads通路中相关因子变化并不显著[27]。以上研究结论差异，表明在心肌细胞中GPR48能否激活TGF-β/Smads通路尚存在一定争议，可能与该通路在GPR48介导的不同生物学过程中所起作用和不同组织器官中的表达存在较大差异有关。虽然GPR48通过TGF-β/Smads途径可发挥多种生物学效应，并且二者均是调控骨形成的重要分子或途径。但有关GPR48激活TGF-β/Smads进而调控骨形成的相关研究尚待补充。运动作为促进骨形成代谢的重要干预手段，其生物学机制与TGF-β/Smad途径被激活后，促进OB分化有紧密联系[28]。那么，GPR48能否通过TGF-β/Smads通路进而在运动促进骨形成中发挥调控作用呢？鉴于GPR48和TGF-β/Smads途径在运动促骨形成中的作用及GPR48与TGF-β/Smads途径之间的调控关系[5]。运动促进骨形成的分子机制可能与GPR48表达上调后激活TGF-β/Smads信号通路，进而促进OB分化、成熟及骨形成能力有关。BMPs与TGF-β具有高度同源性，均通过Smads途径发挥作用。Neogenin作为膜上蛋白，在BMP诱导的经典通路即磷酸化Smad1/5/8过程中，通过与脂质筏相结合从而发挥其介导作用[29]。BMPs信号通路被抑制后，ALK2表达下调导致Smad1/5/8磷酸化异常且不能形成异源三聚体，导致严重的骨生长发育异常[30]。Smad1/5/8被修饰后，其可介导BMPs调控的骨形成并且BMPs信号通路的作用强度可被其膜上受体通过Smad1的C端磷酸化进行调控[31]。BMPs(如BMP-2/3/7等)在调控OB分化和骨形成中均具有重要作用。BMP-2磷酸化后，Smad1/5/8通过与Smad4结合形成磷酸化复合基团，其入核后上调骨钙素等表达，并且短时间BMP-2表达上调对调控OB分化和骨形成是充足且必不可少的，当敲除BMP-2后对骨施加其他骨形成刺激也不能弥补其缺失对小鼠骨形成产生的影响[32]。作为BMPs亚型的BMP-3和BMP-7分别在成骨细胞前体细胞向成熟OB分化和OB骨形成能力发挥上具有重要调控作用。研究证实，GPR48与BMPs/Smads途径存在密切级联调控关系，其表达上调可显著激活BMPs/Smads途径[33]。这与Norrin作为GPR48配体，可上调GPR48表达从而作用于BMP-2的Ser122和Ser132位点并使其磷酸化有关。运动作为促进OB分化和改善骨形成代谢的重要手段，GPR48表达上调不仅可激活BMPs/Smad途径，并且它们分别在运动促进骨形成代谢中均扮演重要调控角色[34]。那么，运动促进骨形成代谢的分子机制可能与GPR48表达上调并作用于BMPs/Smads信号途径，进而促进OB分化、成熟及骨形成能力密切相关。

2.2 GPR48在运动调控骨吸收代谢中的作用机制

2.2.1OPG/RANKL/RANK：OPG/RANKL/RANK是调控OC分化和骨吸收的重要分子轴。OC前体细胞在分化过程中巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor, M-CSF)必不可少，同时亦需要RANKL来激活RANK，从而将级联信号信息传递给连接蛋白-肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor related factor, TRAF) (尤其是TRAF6)，诱导转录因子：C-fos、活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells c1, NFATc1)/NFATc2和核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)成员p50及p52等表达。RANK亦可通过激活OC前体细胞中的C-fos和NFATc1/NFATc2来促进OC分化、成熟及骨吸收代谢[35]。GPR48不仅在骨形成中具有重要作用，在OC分化和骨吸收中亦扮演关键角色。最近研究发现，GPR48是RANKL的另一膜上受体(除RANK)，其与RANK竞争性的同RANKL结合，激活Gαq 和糖原合成酶激酶3β(Glycogen synthase kinase 3β, GSK3β)信号通路，抑制NFATc1表达，OC分化及骨吸收功能显著下降[36]。表明，GPR48与OPG/RANKL/RANK分子轴之间的级联反应是调控OC分化和骨吸收的重要媒介。运动训练抑制OC分化和骨吸收，但不同运动方式和运动负荷对OC分化和骨吸收造成的影响存在较大差异。与向心运动的上坡跑相比，作为离心运动的下坡跑可显著抑制去卵巢小鼠骨中OPG/RANKL/RANK分子轴激活，从而抑制OC分化及骨吸收代谢[37]。当运动负荷不同时，骨中OPG、RANKL mRNA表达量及OPG/RANKL比值亦不同，且当负荷较大时OPGmRNA表达下调，而RANKL的mRNA表达和OPG/RANKL比值显著上升，骨吸收增强[38]。GPR48作为RANK的另一配体，有关运动通过GPR48和OPG/RANKL/RANK分子轴进而调控骨吸收的相关研究尚待揭示。但研究发现，8周下坡跑可通过上调GPR48表达，进而同RANKL竞争性与RANK结合，下调NFATc2和组织蛋白酶K(cathepsin K, CTSK)表达，抑制OC分化、融核，改善T2DM小鼠骨代谢[5]。鉴于GPR48通过影响OPG/RANKL/RANK分子轴在调控骨吸收及在运动改善骨代谢中的重要生物学作用，运动通过激活GPR48，从而与RANKL竞争性同RANK结合，抑制RANK活性，下调靶基因表达，抑制OC分化产生及其骨吸收能力。

2.2.2其他：OPG/RANKL/RANK分子轴借助TRAF6，可调节下游CN/NFAT和NF-κB信号途径，从而介导OC分化和骨吸收代谢。CN/NFAT作为调控骨代谢的重要信号通路，该途径被激活后，CN表达上调促进胞浆中NFATc1磷酸化并入核，激活C-fos、激活蛋白1(activator protein 1, AP-1)等靶基因表达，使得OC数量增加且骨吸收能力增强，骨组织形态结构退化[39]。而抑制NF-κB信号途径可下调其靶基因CTSK、C-fos等表达，抑制OC分化及骨吸收[40]。研究发现，OC上特异性敲除GPR48可激活以上两条信号途径，上调CTSK、C-fos等靶基因表达，促进OC分化和骨吸收[41]。运动不仅可抑制OPG/RANKL/RANK分子轴，并且亦可通过CN/NFAT和NF-κB信号途径失活来抑制OC分化产生及其骨吸收能力，进而改善骨代谢[42]。运动亦可上调GPR48表达，从而与RANKL竞争性同RANK结合，下调NFATc2和CTSK表达，抑制OC分化及骨吸收。CN/NFAT和NF-κB不仅可作为OPG/RANKL/RANK分子轴下游两关键途径，且NFATc2和CTSK亦是以上两途径的关键靶基因[43]。那么，运动抑制OC分化和骨吸收进而改善骨代谢的分子生物学机制，与GPR48通过OPG/RANKL/RANK分子轴，进而作用于下游CN/NFAT和NF-κB信号途径及其靶基因表达密切相关。除以上信号途径外，PI3K/Akt、JNK/AP-1、p38MAPK、ERK、LPS、CD40等亦可将TRAF6作为媒介，与OPG/RANKL/RANK分子轴相连，从而在OC分化和骨吸收代谢调控上发挥重要作用[44]。既然，运动抑制OC分化及其骨吸收能力进而改善骨吸收代谢的分子机制是一复杂、相互耦联的网络。那么，GPR48能否通过调控以上信号途径或者GPR48能否通过调控以上信号途径或关键分子从而在运动抑制OC分化和骨吸收代谢中发挥重要调控作用呢？目前尚待相关研究予以揭示。

3 展望

自2009年首次发现以来，GPR48在骨形成和骨吸收代谢中的关键调节作用已广为认可。本研究拓展了GPR48在调控骨形成和骨吸收代谢上的新分子作用机制。在此基础上，提出经由cAMP/CREB/ATF4、TGF-β/BMPs、OPG/RANKL/RANK等通路可能介导了骨形成和骨吸收代谢的运动干预机制。虽然现有研究文献支持此结论，但仍有几个问题尚需澄清；①介导骨代谢的信号途径或关键调控分子较多，且相互之间是彼此耦联，非线性、单一的调控网络，GPR48介导骨代谢的网络调控途径尚待予以揭示、完善；②GPR48调节骨代谢运动适应的具体分子机制(即哪些信号途径或关键分子发挥作用)以及分子机制调控信号网络尚不明晰；③骨骼肌、炎症反应、能量代谢、血管再生等与骨组织运动适应之间的“Crosstalk”是目前研究热点，而GPR48在以上过程中所扮演的生物学角色及其分子调控机制仍待验证。明确以上问题，将有助于加深对GPR48的了解，有助于阐明其在运动干预调控骨代谢中的分子作用机制，为完善运动干预调控骨代谢的信号网络以及骨相关疾病诊治提供新的靶点和非药物干预手段。