斑马鱼动物模型在骨骼疾病研究中的应用现状分析

尹恒 王建伟 马勇 吴毛 华臻 苏秋菊

1.南京中医药大学无锡附属医院，江苏 无锡 214071 2.南京中医药大学，江苏 南京 210038 3.南京医科大学附属无锡市人民医院，江苏 无锡 214023

在骨骼疾病的动物实验研究中，最常用的模式动物包括大鼠、小鼠、兔等。传统的动物模型有一系列难以克服的缺点，如造模用药周期长、费用高、工作量大等，人们在不断寻找新的动物模型来克服以上缺点。近年来，一种新的模式动物-斑马鱼(zebrafish)逐渐进入了研究人员的视野。

斑马鱼是一个古老的动物模型，于上世纪80年代～90年代初被确立为一种新的模式动物。经过近30年的发展，目前斑马鱼已成为一种常用的模式生物，也是目前被认为可用于提升科研效率的最好的动物模型之一。在骨骼疾病研究中，斑马鱼以其独特的结构与生理，提供了一种全新的、高效而灵活的动物模型。既往的研究涉及骨质疏松与骨代谢、骨发育、骨再生与修复、药物筛选等几个方向。更有意义的是，斑马鱼的两种形态——胚胎鱼与成年鱼阶段各有完全不同的可研究之处，研究者称之为“一体两面”的动物模型。为了下一步研究的开展，作者收集了数据库中的文献资料，对目前斑马鱼的研究作出简要分析综述。

1 文献筛选

1.1 文献来源

以中文“骨、斑马鱼”为关键词,检索知网、万方、维普数据库中的中文文献；以英文“osteoporosis/osteogenesis，zebrafish”为关键词，检索Pubmed、Embase、Web of science数据库中的英文文献，时间区间选取1990年1月-2017年6月。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①原创性；②论点论据可靠；③动物试验类文献。

排除标准：①内容重复的文献；②综述类文献。

1.3 筛选结果

初检共检索到573篇含相关内容的文献。按照纳入与排除标准，初筛得到285 篇文献。经过第二次筛选(阅读摘要筛选，必要时全文筛选)，共纳入107篇文献。文献大体分类包括骨质疏松方向的文献28篇，骨代谢方向的文献18篇，骨发育方向的文献36篇，骨再生与修复方向的文献11 篇，药物筛选方向的文献14篇。此外，在107篇文献中，涉及胚胎斑马鱼文献88篇，成年斑马鱼文献26篇；含转基因研究方向文献12篇。

2 胚胎斑马鱼模型

2.1 胚胎斑马鱼骨组织的发育

与哺乳动物一样, 斑马鱼存在两种不同类型的骨生成方式[1]：从软骨支架骨化(软骨内骨化)或直接从间充质干细胞前体骨化(膜内骨化)。在胚胎期斑马鱼体内，典型的软骨内骨化的部位包括颅骨和咽弓软骨，典型的膜内骨化包括脊椎与鳞片。在细胞水平上,斑马鱼的成骨细胞和破骨细胞与哺乳动物高度相似，因此，胚胎斑马鱼已被广泛应用于骨组织的发育研究。Pasqualetti等[2]利用胚胎斑马鱼评估锶对骨骼发育的影响，评估了锶在胚胎发生过程中是否会影响软骨发育，结果发现锶不会扰乱软骨组织的发育。在矿化过程中，研究者证明了低浓度锶增加脊椎矿化，而高浓度锶抑制矿物沉积，认为在胚胎成骨形成过程中，钙/锶的比例调节了矿化过程。结果表明斑马鱼对于研究微量营养素在组织/器官发育过程中的作用是一种很好的动物模型。Adams等[3]为了研究COL11A1 在颅面和轴向骨骼发育中的功能作用，在斑马鱼身上进行了这种基因的复制。实验结果显示斑马鱼呈现麦氏软骨畸形、脊索缺陷、鱼体短缩、死亡率增加。该结果提供了COL11A1对正常斑马鱼发展至关重要的证据。作者认为斑马鱼能够提供一种用于研究人类软骨营养不良机制的复染动物模型，并能建立潜在的治疗方法。

2.2 胚胎斑马鱼骨组织活体染色

骨组织的发育与重建是一个完整的动态过程，研究者很难在其他动物模型中观察到该过程。胚胎斑马鱼躯体透明度高，便于直视下观察。研究者可以采用非侵入式的荧光染色方法进行活体染色，并进行动态、连续观察。目前常用的荧光染料包括钙黄绿素、茜素红和槲黄素。染色剂可以直接暴露给药，通过渗透作用进入到斑马鱼胚胎中。不同的染色剂可以显示不同的组织结构，给研究带来了极大便利。

钙黄绿素(calcein)在体内专门与钙离子结合，直视下可见绿色荧光色团。骨骼主要由包含钙化的骨基质组成，因此钙黄绿素可用于在胚胎发育期标记骨结构。无毒性和强荧光信号使得钙黄绿素成为活体斑马鱼骨染色最好的染色剂。Du等[4]跟踪了钙黄绿素染色后第1天到第21天的斑马鱼胚胎骨骼结构，并分析了骨形态发生蛋白-2 (bone morphogenetic protein-2，BMP2)对中轴骨发育的影响。发现钙黄绿素染色确实能够标示钙化的骨骼结构，并能用于检测异常的骨发育，表明钙黄绿素染色在斑马鱼胚胎中观察骨结构具有相当的敏感性，以及对有骨结构缺陷的突变体进行筛选的有效性。与只标示绿色荧光的钙黄绿素不同，茜素红(alizarin red)在强光下可见直视下红染，在荧光灯下可见红色荧光。茜素红能够染色骨钙化基质，通过对比阿尔新蓝复染，用来区分软骨和骨骼。韦英杰等[5]在国内首次利用胚胎斑马鱼建立骨质疏松模型，采用茜素红对9dpf斑马鱼颅骨进行染色,以显微检测、数码成像方法定量分析骨骼染色区域，取得了一系列研究成果。槲黄素(quercetin)是一种植物激素，广泛存在于水果和蔬菜(如洋葱、苹果、葡萄)中，可用于染色骨基质。Zhao等[6]使用槲黄素研究胚胎斑马鱼抗血管生成。研究同时发现这种染色剂的活体干预已对胚胎发育和骨生理有影响,因此最好使用其他染色剂。阿尔新蓝(alcian blue)和阿尔新绿(alcian green)用于染色软骨细胞周围细胞外基质中的蛋白多糖。它可用来显示胚胎斑马鱼和成年鱼复染软骨，以此区分软骨和骨。Walker等[7]最早开发了一种无酸的方法，使用阿尔新蓝和茜素红对胚胎斑马鱼软骨和骨骼进行复染，取得了良好的观察效果。同时这种方法还有一个优点，即可以染色标本的PCR基因型。

2.3 胚胎斑马鱼特异性转基因品系的建立

胚胎斑马鱼有一系列研究优势，如胚胎斑马鱼几乎完全透明，便于直视观察；性成熟期约2～3个月，传代时间短，便于繁育；基因可操纵性强，转基因技术较为成熟。这些优势给研究者带来了极大的研究便利，并从不同研究角度建立了各种品系的转基因斑马鱼。Thomas等[8]在最小信号通路反应因素控制下，使用转基因技术在胚胎鱼体内不同的骨骼细胞或组织中表达荧光蛋白，实现了发育中的特定细胞可视化研究。这样的转基因鱼尤其适用在不同的骨骼细胞或组织中表达荧光蛋白。Dale等[9]使用Col2a1转基因斑马鱼品系，比较了两个col2a1同系的表达，并发现了col2a1b的表达，只与col2a1a有部分的重叠，并通过比较基因组序列发现了一个小的高度保守的序列(R2)转录起始位点。Delaurier等[10]在2010年报道建立了一种转基因斑马鱼品系Tg(sp7:EGFP)b1212，用于研究骨骼发育。在这一转基因品系中，绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的表达重新生成了内生的sp7基因表达，并在胚胎斑马鱼骨发育的过程中产生了内生的sp7基因表达。在成年鱼体内也发现了gfp-阳性细胞，并被发现与在截肢后重新生成长的鳍线有关。该转基因品系为进一步研究斑马鱼的囊泡形成和骨骼发育及再生提供了必要的工具。Kim等[11]建立了一种转基因斑马鱼，明确地表达了一种特定于骨胚胎的骨结构，用以区别软骨的发育。研究者在斑马鱼内生的col10a1表达域内，发现了一个2-2-kb的启动子区域col10a1:GFP转基因斑马鱼，该标记只来自成骨细胞，可用于明确骨发育过程。杜兴华等[12]利用To12转座子和Cre-loxP技术构建Tg(nkx2.3:CreERT2)和Tg(nkx2.3:EGFP-CAAX)转基因鱼品系，发现敲低bmper、miR-23a的表达严重影响斑马鱼的颅面骨发育，为与咽囊相关的研究工作提供了重要的工具。

2.4 胚胎斑马鱼突变体基因筛选

突变基因的鉴定是组织和器官发育研究中非常重要的一个方面。通过突变基因,研究者可以明确目标基因在骨正常发育中的作用。在这类研究中,斑马鱼的一个特定优势得以凸显即使用荧光标记转基因胚胎鱼，使得实时监控骨发育成为可能。研究者已进行大规模突变基因筛选，并已确定50多个与软骨和骨骼发育缺陷有关的突变基因。婴儿期的广义动脉钙化是一种致命的人类疾病，大多数病例被认为是由外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶-1(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase-1，ENPP1)的突变引起的。一些假黄色瘤(PXE)的病例最近与ENPP1有关。Apschner等[13]利用斑马鱼ENPP1突变体证明在皮肤、软骨、心脏、脊索等组织中，异位矿化是独立于典型的成骨细胞或软骨标记的表达而发生的。Eames等[14]使用斑马鱼突变体来揭示软骨细胞抑制软骨细胞的成熟。研究者分离了一组突变基因，减少了软骨基质，并增加了软骨下骨。位置克隆鉴定了两种基因，fam20b和xylo三段(xylt1)的损伤，这两种基因都编码了前列腺素(prostaglandin，PG)合成酶。超微结构分析显示变异矩阵组织和突变体中软骨细胞肥大的早期细胞特征。研究发现fam20b和xylt1参与了PG合成。Gray等[15]描述了三种隐性的斑马鱼leviathan/col8a1a突变等位基因(m531，vu41，vu105)，它破坏了col8a1a，并导致了胚胎脊索的折叠，从而导致了成年的脊柱畸形。研究表明，在胚胎发生时，药物在胚胎发生时的短暂性丧失或抑制利syl氧化酶，足以引起成年后的脊椎融合和脊柱侧凸。

2.5 胚胎斑马鱼高通量药物筛选

中药成分的有效性及安全性得到了日益重视，如何进行高通量、快速的筛选，是目前研究人员需要面临的问题。传统的的动物模型在药物高通量筛选中存在各种弊端，如耗时长，成本高等，而体外模型不能完全模拟体内环境，筛选质量可信度不高。近年来国内外研究者利用胚胎斑马鱼这一模型，对各类中药成分进行了大规模、高通量筛选，具有在体化、微板化、实时动态、简单、高效等优势。Fleming等[16]2005年首次利用胚胎斑马鱼开发了一种快速、高通量的活体药物筛选模型，该模型能够识别出在骨骼中产生的代谢作用的药物，活性维生素D3和间断性给予甲状旁腺素(parathyroid hormone，PTH)会促进骨矿化，而持续暴露于PTH则会导致净骨损失。研究者认为该模型具有快速、经济和遗传的可追溯性，能够为哺乳动物模型提供一种强有力的辅助手段。陈颖等[17]利用受精后1 DPF(days post fertilization，DPF)胚胎斑马鱼毒性模型评价26种常见伤科中药材的安全性，发现13种药味(续断等)的水煎液致幼斑马鱼脏器形态明显改变,毒性主要表现为卵黄囊肿大、变形、变黑,心包水肿、出血等,且它们的鱼LC50值较低。其余13种药味(鹿衔草等),未见鱼脏器毒性,且致鱼死亡浓度高。研究者认为斑马鱼模型具有简单、高效、实时动态的优势,使中药在体毒性规模化筛选成为可能。

3 成年斑马鱼模型

胚胎斑马鱼用于研究骨骼系统的发育与药物高通量筛选有着巨大优势，然而,由于缺乏成熟的骨骼，骨组织的代谢、修复和重建无法使用胚胎斑马鱼进行。成年斑马鱼骨属性与人类相似,提示可能成为用于研究人类骨骼疾病的模型，研究者进行了不断探索，目前已复制出数个成年鱼骨病如骨质疏松，用于分析病理生理机制和设计新的治疗方案。因此,成年斑马鱼模型是一个研究骨代谢和骨转换重要的模型。人们在研究中发现,成年斑马鱼的鱼鳍和鳞片各自代表具有独立特征的模型。

3.1 成年斑马鱼模型的检测方法

成年斑马鱼体长约3～4 cm，体表覆盖鳞片。在骨骼疾病研究中，鳞片、脊柱、尾鳍是最常用的研究部位，常用的观察方法如组织提取检测、特异性染色、显微观察、双能X线、Micro-CT等方法均已常规开展。在过去的几年里,断层技术如时间门控光学投影断层分析(TGOPT)被用于成年斑马鱼来重建三维内部结构，斑马鱼完整骨骼系统可由μCT扫描,可进行全身以及特定骨骼(如脊柱)的骨密度(bone mineral density，BMD)测定，全身μCT扫描可进行斑马鱼骨骼系统的3D重建以检测特殊的膳食(如锶)补充后不同的骨骼结构显影，这些检测方法为研究提供了便利条件。Pasqualetti等[18]将成年斑马鱼鳞片进行多种染色，发现鳞片的特定矿化模式和分布在不同区域的成骨细胞分布。沿着外环观察到，在矿化的过程中，鳞片边缘复染细胞在矿化过程发生之前就会迁移并组织起来，表现出碱性磷酸酶活性。内环也以新的矩阵沉积为特征。研究者认为斑马鱼鳞片是分析骨形成和矿化过程中成骨细胞行为的一个非常有效的模型。Kitamura等[19]为研究成骨-破骨细胞相互作用，将6月龄斑马鱼鳞片进行qPCR检测，分析了RANK-RANKL-OPG、semaphorin 4D相关mRNA，发现3.0 g负载振动显著降低了RANKL/RANK功能比，而静态3.0 g加速导致了骨吸收mRNA的表达。Hur等[20]利用Micro-CT检测成年斑马鱼脊椎，进行表型组学研究。在大量的位点上，对数以百计的表型和密度特征进行了分析。发现与人类骨质疏松症有关的表型和甲状腺刺激激素受体过度活跃。Farwell等[21]利用成年斑马鱼再生尾鳍作为活体模型，观察TMEM184 A对再生的血管再生的表达及影响。在Tmem184a分子的作用下，再生尾鳍产生了混乱的再生血管，这些血管不会向外生长，也限制了正常的总鳍的再生。

3.2 骨质疏松模型

胚胎斑马鱼骨质疏松模型目前在国内外得到了广泛应用[22-24]，然而存在如下几个问题：① 胚胎斑马鱼骨骼尚未成熟，正常的骨重建机制尚未完全建立；② 胚胎斑马鱼的躯体较小，约2～4 mm，目前多采用头骨染色观察，其他检测方法难以进行；③ 药物，尤其是中药天然成分的耐受性较差，许多药物试验难以进行。为此研究者近年不断开发成年斑马鱼模型用于骨质疏松研究。Vrieze等[25]将成年斑马鱼暴露于含泼尼松龙药液的水中，取再生的鱼鳞片检测矿物质含量和破骨细胞与成骨细胞的骨基因表达谱。发现泼尼松龙提高了破骨细胞的活性和骨基质的吸收，减缓了钙/磷的摩尔比率的增加，预示着改变骨矿化过程。通过在骨细胞和成骨细胞的时间剖面上的改变，在骨形成和骨吸收的不平衡等方面阻碍再生。研究者认为糖皮质激素能够成功诱导骨质疏松斑马鱼模型，提供一种极其高效的研究工具。尹恒[26]利用成年斑马鱼建立糖皮质激素诱导的骨质疏松(glucocorticoid induced osteoporosis，GIOP)斑马鱼模型，并研究中药龟鹿二仙胶对鱼鳞片矿化、骨胶原结构及TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的影响，发现激素能够成功诱导出骨质疏松的斑马鱼，而鳞片的检测结果可以为后续的研究提供一定参考。

成年斑马鱼骨质疏松模型是一种非常有效的研究工具，具有诸多优势：①斑马鱼易饲养、成本低；②暴露给药方法简便，给药浓度可精确控制；③大幅度缩短造模及给药干预时间，提高研究效率；④分子水平与人类相似度高。这些优势给研究带来了极大的便利。与此同时斑马鱼骨质疏松模型还有一些亟待解决的问题：①目前开展的骨质疏松模型多采用激素诱导，其病理机制与原发性骨质疏松并不完全相同，因此研究结果可能受到影响；②目前斑马鱼模型的检测指标不够统一，不能形成完善的参考体系，导致实验结果的可信度不高；③目前成年斑马鱼骨质疏松研究中，骨标本一般选择脊柱或鳞片，缺乏骨-血清代谢相关性研究；④由于斑马鱼体型的限制，只能进行一次性剪尾法采血，难以进行连续性血清学药效鉴定。因此，需要开展进一步的研究来完善这一模型。

3.3 骨再生与修复

以尾鳍为代表的成年斑马鱼部分组织在截肢或受伤后拥有再生的能力。尾鳍由基底部骨骼、放射状鳞质鳍条(骨组织)、软组织和血管组成[27]。尾鳍的基底部骨骼为软骨内骨化，切除后不能再生。放射状鳞质鳍条不含细胞，为膜内骨化，可实现完全再生，因此被用于研究成熟骨组织的修复和再生能力。Sousa等[28]在成年斑马鱼尾鳍上建立了一个骨折模型，将骨骼放射状骨折，对比截肢模型，发现损伤反应的初始阶段与伤口愈合分子标记的激活是相同的。然而，在骨折试验中，胚芽的表达比在截肢后的再生过程要晚，骨细胞的沉积和基因的表达也被延迟。进一步研究表明，骨骼和血管也会受到影响。表明骨折修复的时间比截肢后再生的时间更长。研究者认为这一新模型可能有助于确定控制骨折的关键过程，并有助于改善人类的骨骼修复。Mahamid等[29]利用同步加速器微光束X射线衍射和小角度散射，结合低温扫描电子显微镜，研究了斑马鱼尾鳍组织的连续矿化过程。前者提供了矿物相和矿物颗粒大小和形状的信息，后者则提供了原生水化组织的高分辨率成像。这两种技术的整合表明，新的矿物是作为一种无定形的磷酸钙纳米球的包裹来运送和沉积的，然后在胶原基质中转化为结晶磷灰石骨板。该研究为尾鳍的再生与修复提供了全新的方向。此外，斑马鱼尾鳍透明度高，有利于活体染色和放射学观察，为研究带来了便利条件，目前已有多种转基因品系用于骨再生与修复。

4 总结与展望

斑马鱼以其“一体两面”独特的结构与生理，为骨骼疾病的研究提供了一种全新的、高效而灵活的动物模型，经过数十年的不断研究，在分子、基因水平均得到了长足的进展，越来越成为人类骨骼疾病基因分析与治疗、药物开发研究方面的重要工具。在中医药研究中，结合传统中医理论，斑马鱼将成为一种快速、高通量筛选中药的一个重要模型，为全面开展药效学、毒理学及药物代谢学等全方面多角度的研究打下基础。