羊小反刍兽疫活疫苗免疫抗体监测

田海芹 朱刚 王恒昌 陈飞飞

（江苏省灌南县畜牧兽医站 222500）

小反刍兽疫也称小反刍兽假性牛瘟、肺肠炎、口炎肺肠炎复合症，俗称 “羊瘟”，是由小反刍兽疫病毒引起的，以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征的急性接触性传染病。主要感染山羊、绵羊等家养和野生小反刍动物，山羊高度易感，绵羊次之[1]。该病是世界卫生组织（OIE）法定报告的动物疫病，在我国划定为一类动物疫病。2007年我国首次在西藏阿里地区确证了小反刍兽疫的发生[2]。2012年 《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020）》将其列入13种重点防范的外来动物疫病。小反刍兽疫病毒树副黏病毒科麻疹病毒属，只有一个血清型[2]。

2014年江苏省连云港市将小反刍兽疫由非免疫区调整为免疫区。根据新疆天康生物股份有限公司生产的活疫苗的使用说明书，其免疫持续期为 “36个月”。在实际使用过程中，不少村级防疫员及养羊户对免疫持怀疑态度，为此灌南县畜牧兽医站在辖区内选取45只羊进行小反刍兽疫免疫试验，探索羊小反刍兽疫抗体的抗体消长规律，并对其免疫效果及防控效果进行观察。

1 材料与方法

1.1 疫苗

小反刍兽疫活疫苗（chone9株）新疆天康生物股份有限公司；疫苗批次2016041。口蹄疫二价灭活疫苗（OHM/02株+JSL株）新疆天康生物股份有限公司；疫苗批次2016017。

1.2 试验动物

选取45只2～36月龄的羊作为试验动物，性别不限，在试验前对45只羊全部采集血清样品，检测小反刍兽疫抗体，结果为阴性者才能纳入作为试验动物。

1.3 免疫方案

每只羊注射1ml口蹄疫二价灭活疫苗（肌肉注射），7d后注射1ml的小反刍兽疫活疫苗（颈部皮下注射）。

1.4 免疫副反应及临床防控效果观察

接种后21d内对被免疫羊进行接种局部观察，对接种种幼畜进行分别观察，精神及采食状态进行观察，以全面了解该疫苗的免疫副反应情况。在试验过程当中，密切观察羊对小反刍兽疫的免疫应答能力。

1.5 血清样品的采集

分别于疫苗接种后的第0、28、84、168、366、550天对羊只进行采血。

1.6 检测方法与试剂

检测方法：阻断ELISA方法检测[3]；试剂盒：小反刍兽疫阻断ELISA抗体检测试剂盒（青岛立见）中国动物卫生与流行病学中心外来动物疫病研究中心（OIE小反刍兽疫参考实验室）生产，批号201641-1及201714-1。酶标仪：Infinite F50酶标仪是Tecan新一代的8通道光吸收酶标仪，不仅能实现快速测量提供准确性高，重现性好的测量结果，而且还树立了结构紧凑的创新性设计新标准。凭借其简洁易用的操作和数据分析软件，Infinite F50可成为ELISA试验一系列应用的理想选择。

检测方法介绍如下：

（1）在A1和B1抗原包被孔中加入阳性血清，50μl/孔。

（2）在C1和D1抗原包被孔中加入阴性血清，50μl/孔。

（3）在E1和F1抗原包被孔中加入稀释液，50μl/孔。

（4）在样品孔中加入稀释液，25μl/孔。

（5）在样品孔中再加入待检血清，25μl/孔。

（6） 37℃孵育 60min。

（7）弃去反应孔中的液体。

（8）每孔用洗涤液清洗4次，洗涤液（1×）300μl/孔。

（9）每次除去洗涤液后，在吸水纸上拍干，除去残留的液体。

（10） 每孔中加入酶标单抗（1×） 50μl。

（11） 37℃孵育 30min。

（12） 重复步骤 7～9。

（13）每孔中加入底物溶液50μl/孔。

（14） 室温中避光作用10～15min。

（15）每孔中加入50μl终止液终止所有反应。

（16）用酶标仪在450nm波长下测定各孔的OD450值，计算阻断率。

阻断率（PB）计算方法：

PB=100-[待检血清 OD450nm（or对照 OD450nm）×100]/cm OD450的平均值。

（17）结果判定：①阳性对照阻断率（PB）＞60，阴性对照阻断率（PB）＜40，试验结果有效，否则重新进行试验；②待检样品阻断率（PB）＞50，判为阳性；③待检样品阻断率（PB）≤50，判为阴性。

2 结果

2.1 小反刍兽疫抗体检测结果

6个时间点抗体检测结果（抗体阳性率）分别为：第0天0%（0/45）； 第 28天 100%（45/45）； 第 84天 97.7%（44/45）；第168天95.6%（43/45）； 第336天90%（40/45）； 第550天67.5%（27/45）。

2.2 免疫副反应及临床防控免疫效果

作者简介：刘坤（1971.11-），女，辽宁省瓦房店市人，本科，兽医师，主要从事动物防疫工作。

所有试验羊未发现明显的免疫副反应情况；试验整个过程未发现试验羊有小反刍兽疫感染情况。

3 讨论

（1）新疆天康小反刍兽疫活疫苗具有良好的免疫原性，在免疫后最近的检测时间第28天抗体阳性率达100%；在免疫后第84天，抗体阳性率为97.7%，略有下降；第168、336天检测，抗体阳性率进一步小幅度下降；在第336天保持在94.5%；随着免疫时间的推迟，在免疫后550d抗体阳性率下降至67.5%。但总体来说，该小反刍兽疫活疫苗免疫持续期至少在550d以上，也就是说一年之内只需接种一次该疫苗，即可获得良好的免疫保护作用。

（2）本次试验最初选用的45只试验羊，因为试验周期比较长，导致后续样本数量因为种种原因（比如出售、转地）略有减少，但对这部分羊的跟踪监测结果比较可靠。

（3）由于小反刍兽疫活疫苗目前仅有新疆天康生物有限公司获得生产批文，对于畜牧兽医工作者及养羊户迫切关心的防控效果及免疫持续期问题。笔者认为，该疫苗防控效果良好，具有良好的免疫原性，作为商品羊只需要接种一次该疫苗，即可有效预防小反刍兽疫，而对于种羊每隔18个月接种一次该疫苗，也能有效地防控小反刍兽疫。