三七总皂苷对A549细胞侵袭转移的影响及机制研究

龚春香 徐微微 邵馨

[摘要] 目的 探讨三七总皂苷（PNS）对A549细胞侵袭转移的影响及机制。 方法 根据培养方法的不同将A549细胞分为对照组、PNS低剂量组（15 mg/L）、PNS中剂量组（30 mg/L）和PNS高剂量组（60 mg/L）。采用Transwell细胞侵袭实验检测A549细胞侵袭转移能力，qRT-PCR及Western blot法检测A549细胞miRNA-379-5p、基质金属蛋白酶（MMP）-2及MMP-9的表达情况。 结果 与对照组比较，PNS低、中、高剂量组中A549细胞侵袭转移能力均下降，miRNA-379-5p表达上调，MMP-2的mRNA及蛋白表达下调，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）；PNS中、高剂量组中MMP-9 mRNA及蛋白表达下调（P < 0.05）。 结论 PNS可抑制A549细胞侵袭转移，其机制可能与PNS上调A549细胞miRNA-379-5p表达和下调MMP-2、MMP-9表达有关。

[关键词] 三七总皂苷；侵袭；miRNA-379-5p；基质金属蛋白酶-2；基质金属蛋白酶-9

[中图分类号] R73-37 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）10（a）-0017-04

The research on the effect and mechanism of Panax notoginseng saponins on invasion and metastasis of A549 cells

GONG Chunxiang XU Weiwei SHAO Xin

Pathology Department， Changzhou TCM Hospital， Jiangsu Province， Changzhou 213003， China

[Abstract] Objective To investigate the effect and mechanism of Panax notoginseng saponins （PNS） on invasion and metastasis of A549 cells. Methods A549 cells were divided into control group， low dose of PNS group （15 mg/L）， medium dose of PNS group （30 mg/L）， high dose of PNS group （60 mg/L） according to different culture methods. Transwell cell invasion test was used to detect the invasion and metastasis ability of A549 cells， qRT-PCR and Western blot methods were used to detect the expression levels of miRNA-379-5p， matrix metalloproteinase （MMP）-2 and MMP-9 in A549 cells. Results Compared with control group， the invasion and metastasis ability of A549 cells of low， medium， high dose of PNS groups decreased， the expression of miRNA-379-5p increased， the expression of MMP-2 protein and mRNA decreased， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）； the expression of MMP-9 protein and mRNA of medium and high dose of PNS groups decreased （P < 0.05）. Conclusion PNS could inhibit the invasion and metastasis of A549 cells， and its mechanism may be related to upregulation of miRNA-379-5p expression and downregulation of MMP-2 and MMP-9 expression in A549 cells induced by PNS.

[Key words] Panax notoginseng saponins； Invasion； miRNA-379-5p； Matrix metalloproteinase-2； Matrix metalloproteinase-9

肺癌患者5年生存率低，而轉移是决定肺癌患者预后的最关键因素。侵袭是肿瘤转移的第一步，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）可溶解细胞外基质，使肿瘤细胞之间黏附减弱，最终使肿瘤细胞进入循环系统，在肿瘤的侵袭转移中发挥重要作用[1]。三七总皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）是五加科人参属植物三七的提取物，是三七主要的生理活性成分，在抗缺氧、抗衰老、提高机体免疫力以及抗炎、抗肿瘤等方面均有较好的活性[2]。既往研究发现，PNS可抑制动脉粥样斑块中MMP的表达[3]，提示其可能具有抑制肿瘤细胞侵袭转移的活性。本研究以肺癌A549细胞株为研究对象，观察不同浓度PNS对其侵袭能力及MMP表达的影响，探讨PNS抑制A549细胞侵袭转移的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 RPMI 1640培养基（批号：875603）和胎牛血清（批号：DPH1628）购自HyClone公司；总RNA提取试剂盒（批号：D339702）购自OMEGA公司；miRNeasy提取试剂盒（批号：133201741）购自QIAGEN公司；实时荧光定量试剂盒（批号：CK7132AB）购自Takara公司；兔抗人MMP-2抗体（批号：AB37150）及兔抗人MMP-9抗体（批号：AB38898）购自abcam公司；鼠抗人β-actin一抗（批号：160213）购自Sigma公司；山羊抗鼠HRP-IgG（批号：161210）和山羊抗兔HRP-IgG（批号：151227）二抗购自中杉公司；PNS（纯度98%，批号：170318）购自云南植物药物有限公司；Matrigel胶（批号：356234）购自美国BD公司；Transwell小室购自美国Corning公司。

1.1.2 细胞 A549细胞购自中国科学院上海生物化学研究所。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与实验分组 使用RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清）在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中进行常规培养。取对数生长期A549细胞，0.25%胰酶消化，调整细胞密度为1×104个/mL，每孔100 μL接种于24孔板中进行传代培养。细胞培养24 h后，分为四组：对照组、PNS低剂量组（15 mg/L）、PNS中剂量组（30 mg/L）、PNS高剂量组（60 mg/L）。每组均设3个复孔，对照组加入DMSO（1∶1000），含药组分别加入相应浓度的PNS处理24 h。

1.2.2 Transwell细胞侵袭实验 Matrigel胶用Opti-MEMI去血清培养基以1∶8的比例稀释后，加入Transwell小室，每个小室50 μL，37℃温箱中放置1 h，使其干成胶状。用Opti-MEMI去血清培养基重悬消化好的细胞，调整细胞密度为1×105个/mL。取细胞悬液100 μL（1×104个细胞）加入已铺Matrigel胶的小室中，PBS溶解PNS，浓度分别为1.5、3、6 g/L，取1 μL分别加入PNS低、中、高剂量组细胞悬液中。在下室中加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基600 μL，在37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，取出小室，用棉签擦去膜上层的细胞，用95%酒精固定15 min后，用结晶紫染色，最后在显微镜下观察，随机取6个视野，统计各组的细胞个数。

1.2.3 qRT-PCR法检测MMP-2、MMP-9的mRNA表达 用OMEGA总RNA提取试剂盒提取各组细胞总RNA，进行qRT-PCR反应，按操作说明书进行。MMP-9上游引物：5′-ACGCAGACATCGTCATCCAGT-3′，MMP-9下游引物：5′-GCACCACAACTCGCATCGTC-3′，产物长度：126 bp，退火温度：60℃；β-actin上游引物：5′-CCGACAGGATGCAGAAGGAG-3′，β-actin下游引物：5′-TGGAAGGTGGACAGCGAGGC-3′，產物长度：130 bp，退火温度：59℃；MMP-2上游引物：5′-TGCCCAAGAATAGATGCTGAC-3′，MMP-2下游引物：5′-GAAAGGAGAAGAGCCTGAAGTG-3′，产物长度：160 bp，退火温度：60℃。PCR反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。

1.2.4 qRT-PCR法检测miRNA-379-5p表达 用QIAGEN的miRNeasy提取试剂盒提取各组细胞miRNA，进行qRT-PCR反应，miRNA-379-5p上游引物：5′-GCGCTGGTAGACTATGGAA-3′，miRNA-379-5p下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，退火温度：60℃。U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，退火温度：60℃。PCR反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。

1.2.5 Western blot检测MMP-2、MMP-9蛋白表达 全细胞蛋白提取，BCA法蛋白定量，蛋白变性后取50 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，湿转法转移蛋白至PVDF膜，以含5%脱脂奶粉的TBST室温下封闭2 h，1∶1000稀释的MMP-2和MMP-9一抗4℃孵育过夜，TBST振摇洗膜15 min×3次，用1∶3000稀释的HRP标记二抗室温孵育1 h后，TBST振摇洗膜15 min×3次。ECL底物化学发光显色后以Image J软件进行条带分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，行单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同剂量PNS对A549细胞侵袭转移能力的影响

与对照组比较，PNS低、中、高剂量组透膜细胞数显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。

2.2 不同剂量PNS对A549细胞miRNA-379-5p表达的影响

与对照组比较，PNS低、中、高剂量组均可上调A549细胞miRNA-379-5p表达（P < 0.05或P < 0.01）。

2.3 不同剂量PNS对A549细胞MMP-2、MMP-9的mRNA表达的影响

与对照组比较，PNS低、中、高剂量组A549细胞MMP-2的mRNA表达均下调（P < 0.05或P < 0.01），PNS中、高剂量组A549细胞MMP-9的mRNA表达均下调（P < 0.05），而PNS低剂量组A549细胞MMP-9的mRNA表达与对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见图2～3。

2.4 不同剂量PNS对A549细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响

与对照组比较，PNS低、中、高剂量组A549细胞MMP-2蛋白表达均显著下调（P < 0.05或P < 0.01），PNS中、高剂量组A549细胞MMP-9蛋白表达亦显著下调（P < 0.05），低剂量组A549细胞MMP-9蛋白表达与对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见图4。

3 讨论

近年来研究发现，PNS可抗肿瘤，其可直接杀伤肿瘤细胞，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞分化，还可增强机体免疫功能，起到抗肿瘤作用[4-8]。但PNS对肿瘤尤其是肺癌细胞侵袭转移能力的影响研究甚少，结合文献报道发现其可抑制动脉粥样斑块中MMP的表达，笔者推测，PNS可能具有抑制肿瘤侵袭转移活性。

肿瘤的侵袭转移是一个连续复杂的生物学过程，其涉及多因素、多水平的调节。MMP是降解细胞外基质最重要的酶类，能降解细胞外基质的许多成分，导致肿瘤的侵袭、转移和血管生成，在肿瘤的发生发展中发挥了重要的作用[9-11]。MMP是一个非常庞大的家族，由20多个具有独特底物和多样性功能成员组成。根据催化底物的不同将MMP分为5类，MMP-2和MMP-9属于Ⅳ型胶原酶，可以降解细胞外基质和基底膜主要结构蛋白Ⅳ型胶原，在肿瘤的侵袭转移中起非常重要的作用。此外，多种miRNA与肿瘤的侵袭转移密切相关[12-15]。既往研究表明，miR-379-5p在抑制肿瘤的浸润转移中发挥了重要作用，其可抑制肿瘤细胞MMP-2和MMP-9表达[16-20]，进而抑制肿瘤细胞迁移和侵袭。

本研究选取肺癌A549细胞作为研究对象，研究了PNS对肿瘤侵袭转移能力的影响及机制，结果显示，PNS具有显著抑制A549细胞侵袭转移能力、显著抑制A549细胞MMP-2和MMP-9的mRNA及蛋白表达以及显著促进miRNA-379-5p表达的作用。本研究结果提示，PNS具有抑制肺癌细胞侵袭转移的作用，其作用机制与其抑制肿瘤细胞MMP-2和MMP-9表达有关，而其对MMP-2和MMP-9表达的抑制可能与其促进miRNA-379-5p表达有关，其机制值得进一步深入探讨。

[参考文献]

[1] Yelken B？魻，Balc？覦 T，Süslüer SY，et al. The effect of tomatine on metastasis related matrix metalloproteinase（MMP）activities in breast cancer cell model [J]. Gene，2017，627：408-411.

[2] Xie Y，Ma Y，Xu J，et al. Panax Notoginseng Saponins as a Novel Nature Stabilizer for Poorly Soluble Drug Nanocrystals：A Case Study with Baicalein [J]. Molecules，2016，21（9）：1149.

[3] Liu Y，Hao F，Zhang H，et al. Panax notoginseng saponins promote endothelial progenitor cell mobilization and attenuate atherosclerotic lesions in apolipoprotein E knockout mice [J]. Cell Physiol Biochem，2013，32（4）：814-826.

[4] Jiang QF，Huang MY，Wu KY，et al. Intervention Effects of Atorvastatin Combined with Panax notoginseng Saponins on Rats with Atherosclerosis Complicated with Hepatic Injury [J]. Pharmacogn Mag，2017，13（51）：430-438.

[5] Shi X，Yu W，Yang T，et al. Panax notoginseng saponins provide neuroprotection by regulating NgR1/RhoA/ROCK2 pathway expression，in vitro and in vivo [J]. J Ethnopharmacol，2016，190：301-312.

[6] Si Y，Zhu J，Huang X，et al. Effects of Panax notoginseng saponins on proliferation and differentiation of rat embryonic cortical neural stem cells [J]. J Chin Med Assoc，2016， 79（5）：256-263.

[7] Wang B，Li Y，Li XP，et al. Panax notoginseng saponins improve recovery after spinal cord transection by upregulating neurotrophic factors [J]. Neural Regen Res，2015， 10（8）：1317-1320.

[8] 譚宏伟，楚光华，胡春艳，等.三七总皂苷对子宫内膜癌Ishikawa和HEC-1A细胞增殖、侵袭和凋亡的影响[J].中国医药导报，2016，13（14）：13-16.

[9] Solov'eva NI，Timoshenko OS，Kugaevskaia EV，et al. Key enzymes of degradation and angiogenesis as a factors of tumor progression in squamous cell carcinoma of the cervix [J]. Bioorg Khim，2014，40（6）：743-751.

[10] Min KW，Kim DH，Do SI，et al. Expression patterns of stromal MMP-2 and tumoural MMP-2 and -9 are significant prognostic factors in invasive ductal carcinoma of the breast [J]. APMIS，2014，122（12）：1196-1206.

[11] Liu Q，Yang P，Tu K，et al. TPX2 knockdown suppressed hepatocellular carcinoma cell invasion via inactivating AKT signaling and inhibiting MMP2 and MMP9 expression [J]. Chin J Cancer Res，2014，26（4）：410-417.

[12] Widodo，Djati MS，Rifa'i M，et al. Role of MicroRNAs in carcinogenesis that potential for biomarker of endometrial cancer [J]. Ann Med Surg（Lond），2016，7：9-13.

[13] Yang L，Liang H，Wang Y，et al. MiRNA-203 suppresses tumor cell proliferation，migration and invasion by targeting Slug in gastric cancer [J]. Protein Cell，2016，7（5）：383-387.

[14] Krutakova M，Sarlinova M，Matakova T，et al. The Role of Dysregulated MicroRNA Expression in Lung Cancer [J]. Adv Exp Med Biol，2016，911：1-8.

[15] Zhang W，Edwards A，Fan W，et al. The modularity and dynamicity of miRNA-mRNA interactions in high-grade serous ovarian carcinomas and the prognostic implication [J]. Comput Biol Chem，2016，63：3-14.

[16] Wu D，Niu X，Tao J，et al. MicroRNA-379-5p plays a tumor-suppressive role in human bladder cancer growth and metastasis by directly targeting MDM2 [J]. Oncol Rep，2017，37（6）：3502-3508.

[17] 陳劲松，黄炯强，董世濠，等.微小RNA-379-5p对肝癌细胞迁移和侵袭的影响[J].中华医学杂志，2016，96（18）：1450-1453.

[18] Chang YC，Chan YC，Chang WM，et al. Feedback regulation of ALDOA activates the HIF-1α/MMP9 axis to promote lung cancer progression [J]. Cancer Lett，2017， 403：28-36.

[19] Chen W，Zhu H，Yin L，et al. lncRNA-PVT1 Facilitates Invasion Through Upregulation of MMP9 in Nonsmall Cell Lung Cancer Cell [J]. DNA Cell Biol，2017，36（9）：787-793.

[20] Qin H，Zhou J，Xu J，et al. The nuclear transcription factor RelB functions as an oncogene in human lung adenocarcinoma SPC-A1 cells [J]. Cancer Cell Int，2018，18：88.

（收稿日期：2018-06-06 本文编辑：张瑜杰）