应用电子捕获解离技术结合金属离子快速识别寡糖异构体

白雪洁+于文静+汪亿晗+石磊+苏蕊+徐锐锋+陈大舟+杨洪梅+刘淑莹

摘要应用傅里叶变换离子回旋共振质谱（ICRMS）的电子捕获解离（ECD）技术对寡糖异构体进行识别。以麦芽七糖、甘露六糖和昆布六糖为研究对象，通过在样品中添加过渡金属离子（Na+、Ca2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+和Co2+），研究不同金属离子对寡糖碎裂的影响。加合Ba2+和Ca2+后的麦芽七糖得到了相同的碎裂离子（0，2A和2，A），Mg2+和Mn2+也具有相似的影响（0，2A、2，A和2，5A），Co2+加合的麦芽七糖也得到了3个交叉环断裂离子（1，A、2，A和2，5A），但对于加合Na+后的麦芽七糖仅得到了一个交叉环断裂离子（0，2A）。 研究发现， 六聚糖的质谱图的信号比相应的麦芽七糖的信号差，应是缔合的金属离子的数量不同导致的结果； 区分寡糖异构体比较好的金属离子为Ca2+、Co2+和Mg2+，其中Ca2+是区分寡糖异构体的更可靠的电荷载体。

关键词傅里叶变换离子回旋共振质谱； 电子捕获解离； 金属离子； 寡糖异构体

1引 言

寡糖是生物体内重要的信息物质，糖在多种生物过程中起着重要的作用，如抗凝活性、免疫调节、抗肿瘤、降血糖、抑制致病微生物、抗氧化、抗炎活性等[1～3]。糖蛋白的糖链部分能调节多种基本功能，例如蛋白质的折叠、运输、定位和细胞转化、分化与反分化等[]，但生物来源的糖蛋白样品往往非常微量，分离纯化的难度大，加上糖链结构的复杂性和技术手段的局限性，对糖链结构的分析远滞后于对其功能的研究，严重制约了糖链结构与功能关系的研究。传统的寡糖的分析方法包括核磁共振（NMR）、气相色谱质谱（GCMS）和单糖的组成分析的结合[5，6]，但NMR灵敏度低，对样品纯度要求高，目前在天然样品的分析中无法得到广泛应用。质谱技术，特别是基质辅助激光解吸电离（MALDI）和电喷雾离子化（ESI）质谱的发展，凭借其灵敏、快速、准确、可分析复杂混合物和利用串联质谱可获得丰富结构信息的优点成为目前阐述糖的结构的重要方法[7，8]。近年来，MALDI及实时直接分析（DAR）源内裂解的方法、离子淌度质谱以及氨基酸辅助ESIMS/MS的方法也都被成功用于糖的异构体的识别[9～12]，但应用这些方法所获得的碎裂类型相似。

电子捕获解离（ECD）一般是通过低能量（<1 eV）的自由电子与质子化的多电荷离子，在相互作用的过程中由于放热而瞬间碎裂，产生电荷减少的自由基物质和产物离子[13～16]。目前ECD与质谱技术联用技术（ECDMS）已成功用于蛋白质及蛋白质糖基化的翻译后修饰的分析[17～22]，ECD的主要特征包括优先断裂二硫键[19]和NCa键[20]。同传统的MS2分析方法比较，ECD的这些特征可以提供补充的结构信息。但ECD很少用于糖的结构的分析，主要是由于糖不可以产生多电荷离子，第一个应用ECD分析质子化糖的研究主要检测到了糖苷键断裂的离子[23]。目前，关于ECD的机理尚不清楚，并且只局限于多肽的研究，一般认为是热氢原子机理[1]。uang等[2]以纤维二糖Mg2+复合物为研究对象，提出了羟基抽提机理。 本研究通过在样品中添加金属离子作为电荷载体，使寡糖产生多电荷离子，应用ECD傅里叶变换离子回旋共振质谱（ICRMS）对产生的二价离子进行分析，获得了独特的用于区分寡糖異构体的交叉环断裂离子。对不同金属离子进行了详细研究，发现碎裂类型具有金属离子依赖性。本研究建立了一种简单、快速、可靠的用于识别寡糖异构体的方法，为未知及复杂糖结构的ECDICRMS解析提供了参考。

2实验部分

21仪器与试剂

Apexultra 9 傅立叶变换离子回旋共振质谱仪（ICRMS，德国Bruker公司），配有Nano ESI源和ECD检测器。麦芽七糖（日本东京化成工业株式会社）； 甘露六糖和昆布六糖（Megazyme国际爱尔兰股份有限公司），麦芽七糖、甘露六糖和昆布六糖的结构如图1所示。醋酸钠、醋酸钙、醋酸钡、醋酸钴、醋酸镁和醋酸锰（北京百灵威科技有限公司）； 甲醇（色谱级，美国EDIA公司）； 实验用水为MilliQ超纯水机（美国Millipore公司）制备的超纯水（182 MΩ cm）。

22ECDICRMS条件

02 mg/mL被分析物与同体积10 mmol/L醋酸盐混合后直接进NanoESI进行分析。

NanoESI源正离子模式采集，Nano喷针流速30 mL/h，毛细管电压18 kV，干燥气温度150℃，干燥气流量3 L/min，ECD脉冲持续时间01 s，ECD偏压05 V，ECD镜头电压13 V，ECD加热电流18 A。

3结果与讨论

本研究使用Domon和Costello命名法[25]定义寡糖的碎片离子，电荷保留在非还原端的离子定义为k，lAi（交叉环断裂）、Bi和Ci（糖苷键断裂），下标i代表从非还原端开始的糖苷键断裂的编号； 电荷保留在还原端的离子定义为k，lXj（交叉环断裂）、Yj和j（糖苷键断裂），下标j代表从还原端开始的糖苷键断裂的编号。无特殊指出时，所有寡糖在正离子模式下主要产生金属离子加合峰。为了更加清晰明了，不同的碎片离子名称用不同的颜色标出，绿色： Y离子； 红色：B离子； 蓝色： 0，2A离子； 紫色： 2，A离子； 粉色：2，5A离子； 棕色： 1，A离子。

31Ca2+作为电荷载体

以麦芽七糖、甘露六糖和昆布六糖为研究对象，Ca2+作为电荷载体获得的结果如图2所示。图2A中除主要获得了B和Y离子，还检测到了大量交叉环断裂的0，2A和2，A离子。为了研究以Ca2+作为电荷载体能否区分糖的异构体，对甘露六糖和昆布六糖进行了分析。对比图2B和图2C可见，图2B中的交叉环断裂离子主要为2，A离子，而在图2C中还检测到2，5A和1，A离子，2，5A碎裂离子在ESI及MALDI串联质谱中无法检测到[9，26]。可见以Ca2+作为电荷载体，可以很容易地识别糖的异构体。另外，通过比较图2中的A、B和C发现， 六聚糖的质谱图的信号比相应的麦芽七糖的信号差，应该是由于缔合的金属离子的数量不同导致的结果[27]，糖链越长，缔合金属离子的能力越强，因此信号越好。endprint

32不同金属离子的比较

不同金属离子获得的结果列于表1。麦芽七糖的ECDICR 质谱图的信噪比较高，因此以麦芽七糖为例分析金属离子的影响。加合Ba2+和Ca2+后的麦芽七糖得到了相同的碎裂离子类型（0，2A和2，A），Mg2+和Mn2+的影响是相似的（0，2A、2，A和2，5A），Co2+加合的麦芽七糖也得到了3种交叉环断裂离子（1，A、2，A和2，5A），但对于加合Na+后的麦芽七糖仅得到了一个交叉环断裂离子（0，2A）。Seipert等[28]研究了影响糖肽ECD碎裂的因素，发现电荷状态、电荷载体和氨基酸组成都会影响碎裂。同时，金属离子的大小对寡糖MALDI碎裂有不同程度的影响[27]，推测是由于金属离子的大小及电荷状态的不同导致的。

从表1获得的甘露六糖和昆布六糖的ECDMS结果可见，Ca2+、Co2+和Mg2+都可作为区分寡糖异构体的金属离子，但使用Ca2+作为电荷载体时能获得更丰富的交叉环断裂离子，因此Ca2+作为识别寡糖异构体的电荷载体更可靠。

结 论

本研究应用ICRMS的ECD技术研究了不同金属离子对寡糖碎裂的影响，对寡糖异构体进行了识别。通过分析比较，麦芽七糖的ECD ICRMS中观察到了较多的交叉环断裂离子，不同连接、不同构型的甘露六糖和昆布六糖的ECD质谱图中观察到的碎片离子也有所不同，细微差别主要由金属离子的大小及电荷状态的不同导致的。区分寡糖异构体比较好的金属离子为Ca2+、Co2+和Mg2+，其中Ca2+是区分寡糖异构体的更可靠的电荷载体。同传统的串联质谱技术相比，ECD的碎裂效率比较低，因此选择能最大化前体离子信号的金属离子是一个需要考虑的重要因素。 本研究证实了ECD技术结合添加的金属离子可以获得常规串联方法无法检测到的独特的交叉环断裂离子，是寡糖结构鉴定的强有力的工具，为使用ECDMS分析寡糖结构提供了理论参考。

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AbstractOligosaccharide isomers were distinguished by electron capture dissociation ourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry （ECDICRMS） in combination with utilizing alkali， alkaline earth， and transition metals （Na+， Ca2+， Ba2+，Mg2+， Mn2+ and Co2+） as charge carriers in electrospray Maltoheptaose， mannohexaose and laminarihexaose were taken as examples to investigate influence of metal ions on the extent of oligosaccharide fragmentation he same types of fragmentation ions （0，2A and 2，A） were obtained for barium and calciumadducted maltoheptaose Mg2+ and Mn2+ had the similar influence （0，2A， 2，A and 2，5A） hree crossring cleavage ions （1，A， 2，A and 2，5A） were generated in the spectrum of cobaltassociated maltoheptaose But in the case of doping Na+ into maltoheptaose， only 0，2A ion was detected It was found that the signals in the spectra of mannohexaose and laminarihexaose were worse than that in the spectrum of maltoheptaose， probably resulting from different numbers of adducted metal ions he isomers， mannohexaose and laminarihexaose could be distinguished by ECDMS in conjunction with the addition of Ca2+， Mg2+ or Co2+ he addition of Ca2+ was the best choice for analysis of oligosaccharides

Keywordsourier transformion cyclotron resonancemass spectrometry； Electron capture dissociation； Metal ion； Oligosaccharide isomerendprint