孕中期无创DNA产前筛查与妊娠结局的研究

黄 贞

(广西百色市人民医院产科，广西 百色 533000)

我国为全球新生儿出生缺陷的高发国家，每年新发先天畸形儿可占到总出生人口数的4%～6%，其中又以21-三体综合征(唐氏综合征，DS)、18-三体综合征(爱德华氏综合征，ES)及神经管缺陷(NTD)等较为多见[1]，患儿出生后多伴有不同程度神经或结构畸形，严重影响人口素质及带给给社会和家庭严重负担，由目前于缺乏有效治疗手段，因此通过产前筛查和诊断预防此类新生儿具有积极的意义。介入性产前诊断是染色体异常检测金标准，但其有创性操作具有一定潜在风险，而血清学生化指标筛查假阳性率较高、敏感性较低。近年来妊娠母体外周血中发现游离胎儿DNA为无创产前筛查和诊断提供了新途径[2]。本文通过对孕妇外周血中胎儿游离DNA进行检测，来评估无创DNA筛查的可行性与准确性，并对妊娠结局进行随访。

1 资料与方法

1.1一般资料：选择2013年1月～2016年9月在我院产前门诊自愿接受无创DNA产前检测的1 036例孕妇为研究对象，孕周为10～21+6周，年龄19～45岁，平均(33.61±4.53)岁。接受无创DNA检测的孕妇情况主要包括以下个类型：①单纯高龄(≥35岁)；②唐氏综合征筛查提示高风险，即21-三体风险值≥1/270、18-三体风险值≥1/350；③产前超声检查提示异常，如胎儿颈项透明层厚度(NT值)异常、胎儿结构异常；④既往有不良生育史；⑤自愿直接行DNA检测。接受无创DNA的孕妇情况：唐筛异常356例(34.36%)，高龄527例(50.87%)，自愿直接DNA检测92例(8.88%)，超声检查异常39例(3.76%)，既往不良孕产史22例(2.12%)。

1.2方法：DNA检测方法：抽取孕妇静脉外周血10 ml，孕妇无需空腹，样本置于EDTA抗凝管中，在44℃条件下经二次离心分离血浆，将提取所得血浆样本置于-80℃冰箱中能保存待测。血浆样本严格按照试剂盒说明书提取DNA，经PCR扩增构建测序的DNA文库，之后采用I2-ples高通量hiseq 2000测序仪进行测序，将所测得序列与人类基因组数据库进行对比分析，计算每条染色体序列数目比率。通过公式计算样本染色体的标准化Z值，如Z值≥3，则认为待测样本为三体高危，反之如Z值<3，则为三体低危。对于提示为高危孕妇者则动员其进行羊水穿刺取样对染色体核型分析确诊。

羊水染色体核型分析：对于DNA检测提示高风险的孕妇，在B超引导下型羊膜腔穿刺，抽取羊水样本进行离心，取沉淀物在37℃、5%二氧化碳培养箱进行羊水细胞培养，培养合适天数后，经处理后得到羊水细胞标本片，进行染色体核型分析。

2 结果

2.1无创DNA检测结果：1 036例标本中共检出21、18、13-三体综合征29例，占2.79%，以21-三体综合征最为多见。具体见表1。

表1无创DNA检测结果(例)

情况例数21三体18三体13三体性染色体异常合计唐筛异常356820010高龄52762109自愿直接DNA检测9220103超声检查异常3911002既往不良孕产史2222105合计10361973029

2.2无创DNA检测与羊水细胞核型分析结果对比：羊水细胞核型分析结果对比，21-三体综合征、18-三体综合征和13-三体综合征无创DNA检测符合率分别为10例(100%)、8例(88.89%)和3例(100%)。

2.3妊娠结局：确诊的10例21-三体者中，自然流产2例，引产8例，无明显原因死胎0例，出现不良妊娠结局者0例；8例18-三体者中，自然流产2例，引产3例，无明显原因死胎2例，出现不良妊娠结局者1例；3例13-三体者中，自然流产0例，引产2例，无明显原因死胎1例，出现不良妊娠结局者0例。

3 讨论

传统的产前诊断方法如羊水穿刺、绒毛穿刺等仍是目前产前诊断金标准，虽然能经常规细胞培养和染色体核型分析获得准确结果，且覆盖面较广，但均为侵入性有创操作，其细胞培养需要较长周期才能获得最终报告，且具有较大的感染、出血甚至流产等风险，尤其是近年来计划生育政策放宽及二胎政策的出台使得高龄孕妇逐渐增多，有创性操作带来更大风险，难以得到孕妇及家属的接受。上世纪90年代国外研究发现孕妇血液循环中存在胎儿游离DNA存在，通过测序技术测定母血浆细胞游离胎儿DNA片段可以确定胎儿染色体倍性[3]，进一步研究分析显示孕妇血浆中的胎儿DAN是以高浓度存在，在孕早期、孕晚期可分别占到血浆DNA总量的3.4%、6.2%，而且在孕7周时孕妇血浆中即可检测到胎儿DNA片段，随着孕周的增加DNA片段浓度也会随之增高[4]。国内研究表明在高风险孕妇孕中期筛查诊断出21-三体8例、18-三体1例及无脑儿1例，随访发现高风险未行产前诊断而出生的唐氏儿1例，染色体数目异常嵌合体均选择引产或中止妊娠，认为孕中期产前筛查诊断对减少出缺陷极其关键[5]。

本研究1036例孕中期孕妇经无创DNA检测显示标本中共检出21/18/13-三体综合征29例，占2.29%，以21-三体综合征共10例，最为多见，这在其他研究[6]中也得到体现。进一步的分析显示与羊水细胞核型分析结果对比，21-三体综合征、18-三体综合征和13-三体综合征无创DNA检测符合率分别为100%、88.89%和100%，与其他研究基本一致。熊敏等[7]报道5例孕妇血胎儿无创DNA检测5例提示21三体综合体者，均经羊水和脐血染色体证实异常，符合率达100%。章容等[8]报道对母血胎儿游离DNA大规模平行测序提示异常的89例进行羊水核型分析对比，结果发现21例-三体、18-三体符合率分别为100%(28/28)、87.5%(7/8)。虽然也有研究[9]认为传统侵入性羊水核型分析结果在检测阳性率方面要高于无创DNA，但总体来说目前的研究大多数支持两种方法诊断符合率较高的结论。

从我国现状来看染色体异常仍是导致新生儿出生缺陷的重要原因之一，其中又以21-三体综合征较为多见，随着无创DNA检测技术提高、信息分析方法优化及检测样本量的增多，该技术在胎儿染色体筛查的应用逐渐广泛，诊断准确性也不断提高。从孕妇外周血对胎儿游离DNA进行染色体诊断，其结果不受孕妇孕周、生育年龄影响，不会对孕妇或胎儿带来额外创伤，经总结我们认为该技术适合以下情况：①年龄≥35岁周岁的单纯高龄孕妇；②唐氏综合征筛查提示高风险、产前超声检查提示异常，且不愿意选择传统侵入性产前诊断检查者；③既往有不良生育史者；④传统侵入性产前诊断检查失败不愿意再次侵入性操作者；⑤自愿接受无创DNA产前诊断者。

综上所述，孕中期无创DNA产前筛查在21/18/13-三体综合征诊断方面与羊水细胞核型分析结果的诊断符合率较高，且具有快捷、无创、准确率高等优点，有望成为一种广泛普及的非侵入性产前筛查新手段。

[1] 吴清明，周 瑾.出生缺陷产前筛查及产前诊断研究进展[J].中国优生与遗传杂志，2011,19(1)：129.

[2] 廖 茜，李 力.胎儿游离DNA用于无创产前诊断的研究进展[J].人民军医，2013,56(9)：1084.

[3] 张有成.母血浆游离胎儿DNA检测在无创性产前诊断中的应用[J].中国优生与遗传杂志，2013,21(5)：1.

[4] 郑 静，卓 越，孙大康，等.不同年龄段孕妇无创DNA产前检测结果对比分析[J].中国妇幼保健，2015,30(36)：6538.

[5] 胡祝明，刘祥印，陈 爽，等.15486例孕中期筛查孕妇妊娠结局随访结果分析[J].中国妇幼保健，2014,29(3)：361.

[6] 陆海燕，郑建丽，杨芳芳，等.孕妇外周血胎儿游离DNA检测在无创性产前诊断中的应用[J].中国优生与遗传杂志，2014,22(10)：78.

[7] 熊 敏，孙 辉，王淑媛.孕妇血胎儿无创DNA产前检测的临床应用探讨[J].中国优生与遗传杂志，2015,23(4)：46.

[8] 章 容，徐聚春，许欢欢，等.5997例母血胎儿游离DNA无创大规模平行测序筛查胎儿染色体数目异常[J].第三军医大学学报，2013,35(16)：1744.

[9] 徐冠英.无创产前DNA检测与传统产前诊断在产前诊断中应用的比较分析[J].中国优生与遗传杂志，2016,24(2)：74.