18F标记苯乙烯基氮杂环化合物的制备

柳银黎，李忠勇,2

(1. 原子高科股份有限公司，北京 102413；2.中国原子能科学研究院，北京 102413)

阿尔兹海默病(AD)是一种进行性的神经退行性疾病，是最常见的痴呆诱因，细胞外老年斑(SPs)是其重要神经病理学特征之一[1-2]。SPs由β淀粉样蛋白(Aβ)构成，以Aβ为生物标志物，研究放射性药物，利用PET技术，可以协助早期诊断AD[2-4]。近年来，大量小分子被用于Aβ显像，而且已有多种PET药物获得美国食品药品监督管理局(food and drug administration, FDA)上市许可[5]，如6-{2-[2-(2-[18F]氟乙氧基)乙氧基]乙氧基}-(E)-3-(4-甲氨基)苯乙烯基吡啶([18F]Florbetapir)和(E)-1-(4{2-[2-(2-[18F] 氟乙氧基) 乙氧基] 乙氧基}苯基)-2-(4-甲氨基)-乙烯([18F]Florbetaben)[6-7]，均具有给电子基团和大共轭结构，这可能是其表现出对Aβ高亲和性的重要原因[8]。对[18F]Florbetapir进行修饰得到一系列18F标记苯乙烯基氮杂环化合物，也具有类似结构特点，有Aβ显像的潜力。

本研究对苯乙烯基氮杂环化合物进行18F标记，制备[18F]Florbetapir、5-{2-[2-(2-[18F]氟乙氧基)乙氧基]乙氧基}-(E)-2-(4-甲氨基)苯乙烯基吡啶(18F-SPy5)、2-{2-[2-(2-[18F]氟乙氧基)乙氧基]乙氧基}-(E)-5-(4-甲氨基)苯乙烯基嘧啶(18F-SPm2)、5-{2-[2-(2-[18F]氟乙氧基)乙氧基]乙氧基}-(E)-2-(4-甲氨基)苯乙烯基嘧啶(18F-SPm5)，并进行质量检验，为研究18F标记苯乙烯基氮杂环化合物作为Aβ显像剂的可行性提供参考。

1 实验材料

1.1 主要仪器与装置

BP211D型分析天平：德国SARTORIUS AG；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器：郑州长城科工贸有限公司；MH-2800A型多用恒温箱：天津奥特赛恩斯仪器有限公司；CRC-25R型活度计：美国CAPINTEC.INC；LC-20AT型高效液相色谱仪、LC-6AD型半制备液相色谱仪：日本SHIMADZU CORPORATION。

1.2 主要试剂与材料

[18F]F-溶液：原子高科股份有限公司；4,7,13,16,21,24-六氧-1,10-二氮双环[8.8.8]二十六烷(K2.2.2)：化学纯，德国MERCK KGAA；无水碳酸钾(K2CO3)、氢氧化钠(NaOH)：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；浓盐酸(HCl)：优级纯，36%～38%，北京化工厂；醋酸铵(NH4OAc，HPLC级)、高效液相色谱乙腈(HPLC-CH3CN，99.9%+)、乙醇(C2H5OH，USP)：美国SIGMA-ALDRICH；无水乙腈(CH3CN)、无水二甲基亚砜(DMSO)：分子筛级别，比利时ACROS ORGANICS；灭菌注射用水(H2O)、氯化钠(NaCl)注射液：石家庄四药有限公司；Light C18固相萃取小柱(C18柱，WAT023501)、Light QMA固相萃取小柱(QMA柱，WAT023525)：美国WATERS CORPORATION；半制备反相高效液相色谱柱(Zorbax Eclipse XDB-C18, 9.4 mm×250 mm, 5 μm)、反相高效液相色谱柱(Zorbax Eclipse XDB-C18, 4.6 mm×250 mm, 5 μm)：美国AGILENT TECHNOLOGIES INC。

2 实验方法

2.1 无水18F-K2.2.2/K2CO3的制备

将回旋加速器得到的[18F]F-溶液通过活化的QMA柱，1 mL K2.2.2/K2CO3溶液(14.4 g/L K2.2.2和3 g/L K2CO3的乙腈/去离子水混合溶液，V乙腈/V去离子水= 96∶4)淋洗[9]，淋洗液于100 ℃及氩气流下蒸干，再加入1 mL无水乙腈， 100 ℃及氩气流下蒸干制备18F-K2.2.2/K2CO3备用。

2.2 标记化合物制备

2.2.118F标记反应条件

18F-SPy5、18F-SPm2、18F-SPm5等18F标记苯乙烯基氮杂环化合物，与[18F]Florbetapir结构类似，示于图1。

选择[18F]Florbetapir放化合成过程为代表，研究标记反应阶段各因素对标记反应的影响。无水18F-K2.2.2/K2CO3中加入1 mL含[18F]Florbetapir标记前体化合物(E)-2-{2-[2-(5-{4-[叔丁氧羰基(甲基)氨基]苯乙烯基}吡啶-2-基氧基)乙氧基]乙氧基}乙基 4-甲基苯磺酸酯的无水DMSO溶液，油浴加热进行标记反应，改变前体化合物溶液浓度、反应温度、反应时间，考察对标记率的影响，确定标记反应的优化条件。

图1 18F标记苯乙烯基氮杂环化合物的化学结构Fig.1 Chemical structures of 18F labelled styryl nitrogenous heterocycles

2.2.2[18F]Florbetapir、18F-SPy5、18F-SPm2和18F-SPm5的合成

无水18F-K2.2.2/K2CO3中加入1 mL相关标记前体化合物((E)-2-{2-[2-(5-{4-[叔丁氧羰基(甲基)氨基]苯乙烯基}吡啶-2-基氧基)乙氧基]乙氧基}乙基 4-甲基苯磺酸酯、(E)-2-{2-[2-(6-{4-[叔丁氧羰基(甲基)氨基]苯乙烯基}吡啶-3-基氧基)乙氧基]乙氧基}乙基 4-甲基苯磺酸酯、(E)-2-{2-[2-(5-{4-[叔丁氧羰基(甲基)氨基]苯乙烯基}嘧啶-2-基氧基)乙氧基]乙氧基}乙基 4-甲基苯磺酸酯、(E)-2-{2-[2-(2-{4-[叔丁氧羰基(甲基)氨基]苯乙烯基}嘧啶-5-基氧基)乙氧基]乙氧基}乙基 4-甲基苯磺酸酯)的无水DMSO溶液，优化条件下进行18F标记反应，加入0.25 mL 10% HCl溶液，120 ℃油浴加热5 min，加入0.825 mL 1 mol/L NaOH溶液和8 mL H2O[10-11]。

2.3 分离纯化

2.3.1C18柱分离 放化合成后的混合溶液通过活化的C18柱，1 mL HPLC-CH3CN淋洗，淋洗液中加入1 mL HPLC-CH3CN和2 mL HPLC-H2O。

2.3.2半制备HPLC纯化 C18柱分离后的溶液通过0.22 μm微孔滤膜过滤后，半制备HPLC(流动相55% CH3CN/45% 20 mmol/L NH4OAc，流速4 mL/min，时间20 min)纯化，采用自动集样器分管接收组分，每2 mL(即0.5 min)一管，收集完成后，分别测量每管活度，收集需要组分并用水稀释5倍。

2.3.3产物溶液制备 半制备HPLC纯化后的溶液通过活化的C18柱，0.5 mL乙醇淋洗，淋洗液中加入4.5 mL NaCl注射液，通过0.22 μm微孔滤膜过滤，得到产物溶液。

2.4 质量控制

目测产品颜色和澄明度，pH试纸测定pH，HPLC(流动相55% CH3CN/45% 20 mmol/L NH4OAc，流速1 mL/min，时间20 min)测定放化纯度、化学纯度和比活度。

3 结果与讨论

3.1 18F标记反应条件优化

3.1.1标记前体化合物浓度对标记率的影响

固定反应温度120 ℃、反应时间10 min，改变标记前体化合物溶液浓度0.1～2 g/L，浓度对标记率的影响结果示于图2a。由图2a结果可知，在选择的浓度范围内，当浓度较低于0.1 g/L时，标记率低于10%，增加溶液浓度，标记率随浓度的增加而增加，1 g/L时标记率约68%，但是继续增加溶液浓度，标记率降低，可能是标记前体化合物量过多，导致副反应发生。

3.1.2反应温度对标记率的影响

固定溶液浓度1 g/L、反应时间10 min，改变反应温度100～140 ℃，温度对标记率的影响结果示于图2b。由图2b结果可知，在选择的温度范围内，标记率随温度的增加而增加，120 ℃时标记率约68%，但是继续增加温度，标记率降低，可能是反应温度过高，导致副反应发生。

图2 标记反应条件的优化Fig.2 Optimization of labeling reaction conditions

3.1.3反应时间对标记率的影响

固定溶液浓度1 g/L、反应温度120 ℃，改变反应时间2.5～15 min，反应时间对标记率的影响结果示于图2c。由图2c结果可知，在选择的反应时间范围内，随反应时间的增加，标记率逐渐增加，10 min时标记率约68%，但是继续增加反应时间，标记率降低，可能是反应时间过长，导致副反应发生。

综上，选择用于[18F]Florbetapir、18F-SPy5、18F-SPm2和18F-SPm5制备的条件为：溶液浓度1 g/L，反应温度120 ℃，反应时间10 min。

3.2 标记化合物的制备

[18F]Florbetapir、18F-SPy5、18F-SPm2和18F-SPm5的放化合成过程示于图3。[18F]F-具有亲核性，但也具有强碱性，容易与质子溶剂形成氢键，导致亲核性降低。利用亲核取代反应进行18F标记时，通常选用非质子溶剂，实验选择无水DMSO作为反应溶剂，V底反应瓶中加入标记前体化合物的DMSO溶液后，溶解18F-K2.2.2/K2CO3，形成淡黄色或黄色透明溶液，标记反应结束后，透明溶液颜色加深。18F标记阶段的标记率分别为48%、62%、36%和27%，说明在选择的条件下，能够实现相关前体化合物的18F标记，虽然标记率较条件研究中低，但均能满足相关实验研究的需求，因此未进一步优化调整。

图3 18F标记苯乙烯基氮杂环化合物合成路线图Fig.3 Radiosynthesis scheme of 18F labelled styryl nitrogenous heterocycles

18F标记反应后，得到带Boc保护的中间产物，利用盐酸脱除Boc基团，加入盐酸后，均变为无色透明溶液，加热反应后，又均变为黄色透明溶液，此时得到目标产物。大量未参与标记反应的标记前体化合物也脱除Boc基团，同时OTs基团也因水解而脱除，生成相应的副产物。得到的含有目标物的混合溶液中含有过量的盐酸，利用氢氧化钠中和，并加入8倍DMSO量的水，将溶液由油相体系转变为水相体系，得到粗产物。

3.3 分离纯化

[18F]Florbetapir、18F-SPy5、18F-SPm2和18F-SPm5的粗产物中，含有大量的副产物，通过C18柱和半制备HPLC两步法分离纯化，其中C18柱分离除去游离的[18F]F-和K2.2.2、K2CO3、DMSO等，半制备HPLC分离化学组分中的副产物。粗产物、C18柱分离后产物、半制备HPLC纯化后产物的HPLC分析谱图分别示于图4～图6。各化合物对照品[19F]Florbetapir、19F-SPy5、19F-SPm2和19F-SPm5的HPLC分析图谱示于图7。从图4～7结果可以看出，C18柱可以有效分离目标物和游离的[18F]F-，但是其化学组分中的副产物无法有效分离，而半制备HPLC可将化学组分中的副产物有效分离。

图4 粗产物的HPLC分析谱图Fig.4 HPLC chromatograms of crude products

图5 C18柱分离后产物的HPLC分析谱图Fig.5 HPLC chromatograms of products after separated by C18 cartridge

半制备HPLC纯化谱图示于图8，分别收集11.0～12.5 min、11.0～12.5 min、7.0～8.5 min和6.0～7.5 min组分，目标产物在乙腈和水的混合溶液中，而且浓度较低，利用C18柱进行富集转化，得到[18F]Florbetapir、18F-SPy5、18F-SPm2和18F-SPm5的制剂溶液，校正后的放化产率分别为17%、30%、20%和15%。

手工操作影响因素较多，放化合成时间较长，放化产率较低，目前，18F药物的生产已实现自动化，其原理与实验室合成一致。自动化合成可以排除各种不确定因素的影响，合成过程稳定性和可重复性均较高，合成时间短，这对于短半衰期核素的放化合成尤为重要。由于本工作属于前期研究，限于实验条件，未采用自动化合成。

3.4 质量控制

[18F]Florbetapir、18F-SPy5、18F-SPm2和18F-SPm5的质量控制结果列于表1。由表1结果可知，[18F]Florbetapir、18F-SPy5、18F-SPm2和18F-SPm5的制剂溶液均为无色澄清透明液体，pH均为7～8，放化纯度均>99%，化学纯度均>98%，比活度均为1.09×107～5.11×107MBq/g，各参数均能够满足相关实验研究的需求。

图6 半制备HPLC纯化后产物的HPLC分析谱图Fig.6 HPLC chromatograms of products after purified by Semi-preparative HPLC

图7 参比化合物的HPLC分析谱图Fig.7 HPLC chromatograms of reference compounds

图8 半制备HPLC纯化谱图Fig.8 Semi-preparative HPLC chromatograms for the purification

表1 质量控制结果Table 1 Results of quality control

4 小结

本研究以[18F]Florbetapir放化合成过程为代表，研究确定了18F标记反应阶段的优化条件：标记前体化合物的溶液浓度1 g/L，反应温度 120℃，反应时间10 min。将该条件用于相关18F标记苯乙烯基氮杂环化合物制备，均能实现前体化合物的18F标记，结果满足实验研究的需求。本研究在此基础上制备了高放化纯度、高比活度的[18F]Florbetapir、18F-SPy5、18F-SPm2和18F-SPm5制剂溶液，为研究18F标记苯乙烯基氮杂环化合物作为Aβ显像剂的可行性提供参考。

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