绵羊精液制备及输精注意事项

蔡世芹

（黑龙江省林口县畜牧兽医局157699）

1 精液采集和保存

绵羊可采用假阴道或电刺激采精，常规检查精子活力和密度。绵羊一次射精量小，直接输精很难控制输入的精子量，通常先对精液用简单稀释液进行稀释后输精。稀释比例、最终输入的精子量及精子浓度取决于输精方式及精液从采集到输精期间的保存方式等。

1.1 液态精液

通常使用的非冷冻精液的稀释液为柠檬酸盐或TriS缓冲液，加上卵黄或者牛奶。牛奶需经脱脂或者高温处理。高温处理的目的是破坏其中对精子有杀灭作用的乳烃素。精液稀释后降温到15℃或4℃保存备用。精液应在采集后8h内使用，此后受精能力逐渐下降，24h后使用受胎率可降低30%。

1.2 冷冻保存

尽管使用简单的稀释液可在短期内保持精子活力，但长时间保存需要冷冻。由于冷冻保存可使绵羊精子严重受损，所以绵羊精液的冷冻保存存在一定的困难。冷冻保存的绵羊精液不宜用于阴道内输精，虽然可进行子宫颈输精，但生育力仍相对较低。冻精宫颈内输精也有许多问题，主要是在子宫颈内输入一定量的冻精时，要求其要含有足够量的精子 （总精子量要达到 1.5×108～2.0×108）。 由于子宫颈腔的解剖特点，输入的精液量不能超过0.25ml，因此稀释比例应限制在1∶1～1∶4。 但由于稀释液总量受到限制，其提供的保护不足以抵抗冷休克和冻害，冷冻-解冻后仅有中等数量的精子具有功能。子宫内输精时所需精子数量较少，可以适当提高稀释倍数，因此，更适合于冷冻保存精液。由于精液直接输入子宫，精子活力低于子宫颈内输精，而受胎率可与同期发情后的自然配种相当。

1.3 稀释液

早期采用的稀释液以柠檬酸盐、卵黄、葡萄糖和果糖等单糖和牛奶为基础，其他冷冻稀释液主要由二糖（如乳糖）、三糖 （如棉子糖），多糖复合物 （阿拉伯胶）或者其他复合分子（如聚乙烯吡咯烷酮，PVP）组成。甘油浓度受到稀释液中其他成分如卵黄和糖类含量的影响，适宜浓度在4～6%。早期研究表明，甘油在5℃添加或者分步添加较为适宜，但目前在实践中通常在大约30℃时添加。目前广泛使用的两种稀释液是Tris-柠檬酸-卵黄液和Tris-柠檬酸-果糖-卵黄液。用于宫颈内输精的精液在低倍稀释时存在许多问题，有人已将此问题解决，即在制备冻精时，应先将高浓度的稀释液按 1∶1～1∶4 的比例进行稀释， 然后将稀释后的稀释液用于冻精的制备，从而优化稀释液与精清的体积比，有效提高精液的稀释倍数，避免精液在低倍稀释时存在的问题。还有人使用不同比例的两种稀释液 （卵黄-乳糖稀释液和甘油脱脂奶稀释液），按最终稀释比例进行调整，同样也能解决该问题。

1.4 冷冻程序

精液稀释后缓慢从30℃降到5℃，如果降速过快会导致精子存活率降低。因此，将精液冷却到5℃一般需要1.5～2h，最好用水浴冷却降温。在冷却过程中，精子与甘油逐步达到平衡，可在干冰表面制备颗粒冻精，或用液氮熏蒸制备片状冻精。冷冻后不同公羊精子的成活率差异很大，有的公羊精液不能耐受冷冻过程。冻精颗粒可在水中解冻，通常解冻温度为35～40℃。片状冻精可以放入干燥试管中在水浴中解冻，也可在预热的解冻液中溶解。建议将颗粒冻精在40℃解冻，并保存在30℃水浴中备用。

2 输精注意事项

实施绵羊人工授精相对较为困难。母羊一般只有在有公羊存在时才表现发情行为，因此，为了确定输精时间，需要人工控制发情开始的时间或利用公羊进行发情鉴定。可以采用药物处理诱导同期发情，以确定母羊可受配期；也可以用繁殖功能受损或结扎输精管的公羊试情。绵羊人工授精投入较高，如饲养公羊、购买药品、控制母羊同期发情、人工授精操作等，在决定是否采用人工授精时，应考虑人工授精使绵羊胴体和羊毛品质提高带来经济利益的同时，还应考虑授精成本。目前，限制绵羊人工授精最重要的因素是输精方法。由于母羊子宫颈弯曲，很难直接将精液输入子宫内。子宫颈内输精的受胎率和产羔率都低于自然交配。目前广泛使用的技术有：阴道内人工授精、子宫颈管内人工授精、经子宫颈子宫内输精和腹腔镜子宫内人工授精。