中药活性成分抗缺血性脑细胞凋亡实验研究进展*

李 宁，王 军

(1.河南中医药大学2016级硕士研究生，河南 郑州 450046； 2.河南省中医药研究院中药研究所，河南 郑州 450004)

脑血管病以其高致残率、高死亡率和高复发率的特点严重危害人类的健康与生活质量，并给患者带来巨大的经济负担。其中，缺血性脑血管病占脑血管病总数的60%～80%[1-2]。缺血性脑损伤是由于能量耗竭引起的级联反应，包括细胞内钙超负荷、自由基损伤、花生四烯酸代谢、兴奋性氨基酸的神经毒性、炎症级联反应等，并形成恶性循环而导致神经元坏死和凋亡[3-6]。缺血及缺血再灌注导致的神经细胞死亡主要表现为被动的细胞坏死和主动的细胞凋亡两种形式[7-10]，而缺血性神经元凋亡主要通过由B淋巴细胞瘤-2基因 (Bcl-2) 家族基因、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 (caspase) 家族基因参与的以线粒体为中心的凋亡和由脂肪酸合酶 (Fas) 基因参与的以死亡受体为介导的凋亡两种途径[11]。因此，及时有效地控制与纠正半暗带的缺血状态、积极干预细胞凋亡过程是治疗缺血性脑损伤的关键之一。中药治疗脑缺血以其药效物质多成分、多途径、多靶点发挥药效的特点已显示出明显的神经细胞保护作用，其部分作用机制与调节神经细胞凋亡信号传导通路及调控蛋白有关。

1 三 七

三七为五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen 干燥根和根茎，具有散瘀止血、消肿定痛之功效，以及扩张血管、抗氧化、改善脑循环等药理活性，临床广泛用于缺血性脑损伤的预防与治疗。研究[12]表明：三七总皂苷能明显抑制人β淀粉样蛋白25-35(human amyloid beta peptide 25-35, Aβ 25-35)诱导的 PC12细胞活力下降和乳酸脱氢酶(LDH) 漏出，减少活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)和 丙二醛(MDA)的产生，增加超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT) 和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px )活力，稳定线粒体膜电位，抑制caspase-3 的活化，上调PC12 细胞细胞核Nrf2 、总 Nrf2和细胞质中HO-1 的蛋白表达。三七总皂苷可能通过上调Nrf2 /HO-1 信号通路，从而抑制 Aβ25-35诱导 PC12细胞氧化应激和凋亡。臧妍妍等[13]通过原代培养大鼠脑微血管内皮细胞，采用氧糖剥夺法制备内皮细胞缺血损伤模型，观察三七总皂苷对缺血性血管内皮细胞凋亡及转化生长因子-β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达的影响，结果显示：三七总皂苷可抑制脑血管内皮细胞凋亡，上调 VEGF表达，促进血管再生。康立源等[14]通过体外原代培养大鼠胎鼠大脑皮质神经元细胞(CNC)，采用缺氧/复氧诱导皮质神经元细胞氧化应激损伤模型，发现三七总皂苷可能通过增加抑制凋亡基因Bcl-2 的表达，抑制促凋亡基因Bax 的表达和caspase-3 的活性等作用抑制神经元缺氧/复氧诱导的细胞凋亡。

刘宗超等[15]研究发现：三七三醇皂苷能明显缩小局灶性脑缺血再灌注模型大鼠脑梗死体积，降低脑组织白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)和细胞间黏附分子-1 (intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1) 表达，显著抑制神经细胞凋亡，减轻再灌注后脑损伤。另有实验显示：三七三醇皂苷具有增强缺血诱导的脑缺血耐受作用[16]，可上调胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor, BFGF)的表达[17]，改善脑自体神经干细胞(neural stem cells, NSCs)的生存微环境，促进脑自体神经干细胞的增殖，进而改善大鼠的脑神经损伤[18]。此外，三七三醇皂苷能下调局灶性脑缺血模型大鼠脑组织caspase-3 蛋白表达，显著减少神经细胞凋亡，明显缩小脑梗死面积[19-20]。

2 丹 参

丹参为双子叶植物唇形科鼠尾草植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根茎，始载于《神农本草经》，具有活血调经、化瘀止痛、凉血消痈、清心除烦等功效。丹参主要含脂溶性和水溶性两大类成分，其中脂溶性成分多为丹参酮类化合物如丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、异丹参酮Ⅰ、异丹参酮Ⅱ等，具有改善器官血流量、抑制血小板聚集、提高耐缺氧能力等药理作用；水溶性成分主要为多聚酚酸类化合物，有丹酚酸 A、B、C、D、E、F、G和丹参素等，是丹参活血祛瘀的主要活性成分[21-22]。

韩若东等[23-26]研究表明：丹参酮ⅡA 对大鼠早期脑缺血、局灶性脑缺血及全脑缺血再灌注损伤均具有明显的神经保护作用，其作用机制与上调 Bcl-2蛋白表达，下调 Bax、Drp-1、TRPM7及caspase-3蛋白表达，增加 GSH-Px 的活性，清除氧自由基有关，从而抑制细胞凋亡，降低脑梗死体积。张建平等[27]采用无血清法培养新生大鼠海马神经干细胞(neural stem cells, NSCs)，采用氧-糖剥夺和再灌注(oxygen glucose reperfusion，OGD-R)法体外模拟建立脑缺血再灌注损伤模型，探讨丹酚酸B对OGD-R新生大鼠海马NSCs的保护作用。结果显示：丹参水溶性成分丹酚酸B可提高OGD-R新生大鼠海马NSCs的细胞存活率，抑制细胞凋亡，促进细胞增殖。赵旭等[28]发现：丹酚酸B能显著上调局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织Bcl-2 蛋白和mRNA表达，下调Bax 蛋白和mRNA表达，抑制细胞凋亡。此外，丹酚酸B对脑缺血再灌注小鼠大脑皮层及海马CA1区细胞凋亡亦具有明显的抑制作用，其机制与Bcl-2/Bax 平衡调节有关[29]。

3 人 参

人参为五加科人参属PanaxginsengC.A.Mey.植物，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津安神之功效。人参的主要活性成分为人参皂苷和人参多糖。人参皂苷可分为齐墩果烷型五环三萜类皂苷 Ro、人参二醇型皂苷 (如Rb1、Rb2、Rc、Rd、F2、Rg3、Rh2 等) 和人参三醇型皂苷 (如Re、Rg1、Rg2、Rf、Rh1等)[30]。人参皂苷的药理作用主要体现在对心、脑血管的保护[31]，而人参多糖主要表现为对机体免疫功能的调节[32]。

人参皂苷能明显抑制局灶性脑缺血再灌注大鼠海马CA1 区神经细胞的凋亡，具有明显的神经营养和保护作用[33]。刘霞等[34]的实验显示：人参皂苷Rg1可显著抑制局灶性脑缺血再灌注大鼠大脑皮层缺血半暗带caspase-3 蛋白表达，并具有剂量依赖性。人参皂苷Rg1 能显著降低脑缺血再灌注大鼠海马CA1 区神经元凋亡率，作用机制与抑制脑缺血后海马CA1 区的JNK 及其效应分子c-jun 的活化，调节死亡受体、线粒体依赖的凋亡途径，减少神经元凋亡，降低缺血后迟发性神经元死亡，控制缺血半暗带向梗死区的发展，以发挥其对脑缺血再灌注损伤的保护作用[35]。人参皂苷Rg1 亦可通过调节Bax 、Bcl-2 蛋白表达来减少缺血再灌注损伤后脑细胞凋亡[36]。此外，人参皂苷Rb1 可显著降低局灶性脑缺血模型大鼠脑组织细胞凋亡，其作用机制与上调NAIP 和Bcl-2 蛋白表达和降低Bax 蛋白表达有关[37]。

4 川 芎

川芎为伞形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根茎，具有活血行气、祛风止痛之功效。川芎的化学成分包含苯酞及其二聚体、生物碱、有机酸酚、多糖，以及脑苷脂和神经酰胺等类化合物。其中川芎嗪是研究最多、应用最为广泛的主要活性物质，具有抗血小板凝聚、抗氧化应激、扩张细小动脉和提高心脑器官血流量等生物活性[38-39]。

Zhao T等[40]的体内外研究表明：川芎嗪对双侧颈总动脉阻断血管性痴呆模型大鼠及葡萄糖剥夺PC12损伤细胞模型均具有明显的神经保护作用，抑制细胞凋亡，其作用机制与调节脑衍生神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein，MCP-1)、同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)表达，抑制 Bax/Bcl-2 与 caspase-3凋亡途径有关。田园等[41]的实验显示：川芎嗪能明显减轻大鼠缺血再灌注脑损伤，抑制神经细胞凋亡，其部分机制与川芎嗪抑制葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP 78)和caspase-12 表达有关。

5 银杏叶

银杏叶为银杏科植物银杏GinkgobilobaL.的干燥叶，具有活血化瘀、敛肺平喘、止痛之功效，具有抗氧化、清除自由基、改善循环、抗血小板聚集、保护神经系统等多种药理活性。银杏叶的主要活性成分包括银杏黄酮和银杏内酯两大类。前者具有调血脂、舒张血管、抗氧化等作用；后者为选择性血小板活化因子抑制剂，具有抗血小板聚集和抑制血栓形成等作用[42-43]。银杏叶不同提取物制剂被临床广泛应用于心脑血管疾病的预防与治疗。

银杏叶提取物(银杏内酯)可显著减少大鼠脑缺血再灌注 24 h、2 d、5 d 后脑组织细胞凋亡，抑制脑组织c -fos 蛋白表达，减轻局灶性脑缺血再灌注损伤[44]。范崇桂等[45]采用线栓法制备局灶性脑缺血大鼠模型，观察银杏叶提取物对脑组织凋亡基因和相关蛋白表达的影响，结果显示：银杏叶提取物可显著下调caspase-3 和 Bax mRNA 和蛋白表达，明显上调Bcl-2 mRNA 和蛋白表达，降低脑组织细胞凋亡。牟芳芳等[46]发现：银杏叶提取物EGb761可显著增加局灶性脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑组织Bcl-2/Bax 蛋白表达比值，减少神经元凋亡，降低脑梗死体积。

6 葛 根

葛根为豆科植物野葛Puerarialobata( Willd.) Ohwi 的干燥根，具有解肌退热、透疹、生津止渴、升阳止泻之功效。葛根的化学成分主要包括异黄酮类(葛根素、大豆苷元、大豆苷等)、三萜类、香豆素、葛根苷类、生物碱，以及其他化合物。葛根素作为葛根异黄酮的主要成分，在心脑血管系统方面起重要的药理作用[47]。

葛根素可明显抑制1-甲基-4-苯基碘化吡啶(1-methyl-4-phenyl iodide pyridine, MPP+) 诱导的PC12 细胞凋亡，其机制与降低丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase, MKK)、c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、转录因子c-Jun 的磷酸化及细胞色素C的水平进而抑制JNK 信号通路及线粒体依赖性caspase 级联反应[48]。JAK-STAT 信号途径与脑缺血再灌注密切相关, STATs是该信号途径中JAKs 的下游底物，STAT3 蛋白是其中重要成员之一，广泛分布于神经系统。陈媛等[49-50]采用线栓法制备大鼠左侧大脑中动脉闭塞模型，采用Longa 评分法进行神经功能缺损评分，采用TTC 染色法测定脑梗死体积，采用TUNEL 法检测凋亡细胞数，采用免疫组织化学法检测海马组织磷酸化的 STAT3(P-STAT3)、JAK2(P-JAK2)、STAT3(P-STAT3) 及细胞凋亡因子P53的表达，用以研究葛根素在大鼠脑缺血再灌注损伤后的神经保护作用机制。结果表明：葛根素能显著降低神经功能缺损评分，明显减少脑梗死体积与凋亡阳性细胞数，其神经保护作用机制与抑制 STAT3 的磷酸化水平、降低 P53 的表达及JAK2 /STAT3 信号通路异常激活有关。

7 灯盏花

灯盏花为菊科植物短葶飞蓬Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.的干燥全草，具有微寒解毒、祛风除湿、活血化瘀、通经活络、消炎止痛之功效。灯盏花的化学成分主要包括黄酮类、咖啡酸酯类、芳香酸等。其中，灯盏花黄酮类有效成分——灯盏花素(如灯盏乙素和灯盏甲素)临床运用最为广泛。研究[51-55]表明：灯盏花素对新生大鼠缺氧缺血模型、大鼠脑缺血-再灌注模型及小鼠全脑缺血再灌注模型脑组织神经细胞凋亡均具有明显的抑制作用，其机制与调节Bax/Bcl-2基因表达、下调caspase-3 、NF-kB 及Fas 蛋白表达等有关。

8 红景天

红景天为景天科植物大花红景天Rhodiolacrenulata(Hook.f.et Thoms.) H.Ohba 的干燥根和根茎，具有补气清肺、益智养心之功效。用于研究和治疗缺血性脑损伤的红景天主要活性成分为红景天苷。红景天苷能够改善MCAO 大鼠的神经功能损伤，抑制神经细胞凋亡，主要是通过激活PI3K/AKT 信号通路，促进AKT 的磷酸化，激活NRF2 的核转录，促进HO-1 的蛋白表达，进而抑制神经细胞凋亡，改善神经功能[56]。红景天苷有明显的抗凋亡作用，其机制可能与增加Bcl-2 阳性细胞的表达、降低Bax 阳性细胞的表达、提高Bcl-2/Bax 表达比有关。提示红景天抗凋亡作用与抑制线粒体凋亡途径有关[57]。红景天能抑制大鼠脑缺血再灌注后脑组织中原癌基因c-Fos 表达，减少神经元凋亡，减轻缺血再灌注损伤[58]。

9 黄 芪

黄芪为豆科植物膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge的根，具有补气固表、托毒排脓、利尿、生肌之功效。黄芪多糖和黄芪甲苷为黄芪用于治疗缺血性脑损伤的主要活性成分。黄芪多糖可增加凋亡抑制基因Bcl-2、降低凋亡促进基因Bax 蛋白表达以减少脑缺血再灌注大鼠脑组织细胞凋亡[59]。杨龙等[60]研究发现：黄芪甲苷可抑制局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠氧化应激损伤，下调NF-kB蛋白表达，抑制神经细胞凋亡。王琰等[61]的实验表明：黄芪多糖能显著抑制大鼠脑缺血再灌注损伤后的神经细胞凋亡，下调caspase-3蛋白表达，并具有明显的剂量依赖性。

10 小 结

凋亡一般是指机体细胞在发育过程中或在某些病理因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡。缺血性神经细胞凋亡是脑损伤后脑细胞死亡的重要途径之一，多种信号通路、多种调控基因和蛋白参与了缺血及缺血再灌注脑细胞凋亡的病理生理过程，阻断凋亡通路或干预调控蛋白被证明是治疗缺血性脑损伤的有效手段。中药治疗脑缺血有着可靠的疗效已被大量、长期的临床实践证明。中药多种活性成分(如三七皂苷、人参皂苷、丹参酮ⅡA、川芎嗪、银杏内酯、葛根素、灯盏花素、红景天苷、黄芪多糖和黄芪甲苷等)能明显抑制缺血及缺血再灌注脑损伤导致的细胞凋亡，作用机制与调节Bcl-2/Bax 蛋白比值、降低caspase级联反应、抑制NF-kB及Fas蛋白表达等多种多种信号通路有关。