猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测及注意事项

廖跟东 （广西田东县动物疫病预防控制中心 531500）

猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测是检测猪血清或血浆中猪瘟病毒抗体水平的一种方法，是检验免疫效果的重要依据。检测过程中如果不严格遵守操作规程检测，将对检测结果产生影响，现将本人多年来检测操作及注意事项归纳如下，供大家参考。

1 样品准备

血清稀释板中，用样品稀释液按1∶1比例稀释待检血清、阳性和阴性对照血清 （例如∶120μl样品稀释液中加120μl待检血清）。

2 洗涤液准备

将20倍浓缩洗涤液恢复至室温 （20～25℃），摇动使沉淀溶解，然后用蒸馏水或纯水作20倍稀释，混匀 （例如10ml的浓缩洗涤液加上190ml纯水）。

3 操作步骤

（1）取抗原包被板加稀释好的洗涤液200μl，无需静置，直接甩掉孔中洗涤液，在吸水材料上拍干，重复洗涤共计洗板2次 （如用洗板机洗涤，最后一次拍干）。

（2）将稀释好的待检血清、阳性和阴性对照血清各取100μl加入到抗原包被板孔中，阳性对照和阴性对照各设2孔 （轻轻振匀孔中样品，勿溢出），用封板膜覆盖包被板，置37℃孵育 2h。

（3）掀弃封板膜，甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200μl，无需静置，直接甩掉孔中洗涤液，在吸水材料上拍干，重复洗涤共计洗板5次 （如用洗板机洗涤，最后一次拍干）。

（4）每孔加酶标记物100μl，用封板膜覆盖包被板，置37℃孵育 30min。

（5）洗涤5次，方法同3.3。

（6）每孔先加底物液 A50μl，再加底物液 B50μl，轻微振动反应板混匀，室温 （20～25℃）避光显色1min。

（7）每孔加终止液50μl，轻微振动反应板混匀。

（8）设置酶标仪测量波长为630nm，10min内测定各孔OD630nm值。

4 结果判定

试验成立条件是阴性对照的平均OD630nm＞0.5，阳性对照的阻断率均＞50%。如果试验不成立有可能是实验操作失误造成，再操作一次。S为样品OD630nm值，N为阴性对照平均OD630nm值。

阻断率=（1-S/N）×100%。如果阻断率≤30%判为阴性，如果阻断率≥40%判为阳性，阻断率在30～40%，该样品判为可疑。

5 检测中应注意事项

（1）在抗原包被板设阴、阳性对照各2孔，每孔的阴、阳血清稀释来源于同一个稀释孔稀释 （即一次稀释总量为240μl，移液器吹匀后分两次吸取，每次取100μl加到抗原包被板孔）。

（2）实验过程使用一次性枪头移液器标准操作 （吸液时摁到第一挡位，弃液时摁到第二挡位），使用多孔道移液器时，观察每孔道的吸液量是否一致，如不一致，要压紧吸头。

（3）试剂盒保存温度为2～8C，避免紧贴冰箱壁，造成试剂结冰。未用完的反应板应密封保存在密封袋里，2～8℃保存。

（4）所有试剂用前应恢复至室温 （20～25℃），回温至少20min。加底物前确保底物液A、B在室温 （20～25℃），回温至少30min，且不能将A、B液混合后加入反应孔，否则结果不准确。

（5）在37℃恒温箱孵育时，说明书上没有对反应板作任何要求的不能对反应板贴膜或加盖子、湿毛巾等，否则结果不准确。

（6）不同批次试剂盒组分不能混用，尤其是反应板，对照及酶标抗体，避免影响实验结果。

（7）待检血清样品数量较多时，应先使用血清稀释板稀释完所有待检血清，再将稀释好的血清转移到抗原包被板上，使反应时间一致。

（8）实验时，环境温度控制在20～25℃，实验过程不要将反应板直接放在冰冷的台面上。否则结果不准确。

（9）如出现连续多次或多人实验检测结果异常时，应更换酶标仪测定，验证原酶标仪是否可能出现故障。