兽药残留检测中不容忽视的几个问题

刘春龙

（山西省饲料兽药监察所 030027）

兽药残留检测是保障动物性食品质量安全的重要手段，然而畜禽样品组成复杂、药物残留浓度极低、操作步骤繁琐，普遍存在前处理对检测结果影响程度高、仪器性能要求高、检测技能要求高、回收率低的 “三高一低”特点。认真研究标准，把握好检测中的关键环节，处理好标准中的每个细节问题，才能取得满意的检测结果。

1 准确理解和运用标准

兽药残留检测按分析步骤划分，可分为试料制备、提取、净化、浓缩、衍生化、酶解、仪器测定等步骤。但由于畜禽药物的多样性，各种药物在不同动物、不同组织内代谢与分布的复杂性，不同检测样品的基质效应和干扰成分存在显著差异，应分别采取不同方法检测，这样造成残留检测标准多种多样、名目繁多。不同标准涉及的检测原理和反应类型不同，所采用的试剂耗材、操作步骤、检测细节存在差异，在检测时一定要认真分析标准，准确理解和运用标准。

首先要准确理解检测原理，弄清楚每一步骤涉及的反应类型。畜禽样品组成复杂，基质干扰严重，检测时需进行除杂净化；有的药物还要通过衍生化、酶解等过程才能转化为可检测的形式，这些都要涉及物理、化学反应及生化反应。对于只涉及物理变化的步骤，如去除脂肪用途的正乙烷和异辛烷、起脱水作用的无水硫酸钠等，对检测结果影响不大，用量不必要精确控制，可根据样品中的脂肪含量和含水量而定，离心时的离心力、离心时间设置也是如此，能达到溶液澄清即可；但对于一些能影响化学反应的试剂则要严格控制，如盐酸、乙酸、碳酸钠等酸碱性物质，及许多化学反应物，其浓度和用量不准会改变溶液体系的pH，影响药物定量反应的形成及提取、净化、酶解效果；生化反应还对温度等因素敏感，应予准确控制。

其次在标准的应用中，不仅要严格执行操作规程，还要熟悉相关技术规程中的一些具体要求。如试料制备、溶液配制、数据处理和质量控制等过程应遵照《兽药残留实验室质量控制规范》、《数值修约规则与极限数值的表示与判定》、《常用玻璃量器检定规程》等规程。如果不了解这些 “共同规程”中的细节内容，照本宣科，势必造成标准执行上的偏差。

2 避免损失与防止污染

畜禽产品的兽药最高残留限量基本都在1mg/kg以下，即百万分之一（ppm）级别，许多禁用药要求十亿分之一（ppb）或更低，无疑属于痕量分析范畴。痕量分析对外部环境敏感，检测时最基本的一个要求就是要避免损失和防止污染，它们对检测的 “特异性、灵敏度、准确度和精密度”具有很大影响。

这是因为在痕量检测中，为了除去共存杂质的干扰，提高检测灵敏度和保护仪器都要进行复杂的净化萃取、富集浓缩等步骤，进行繁琐的液体转移、溶剂移取和蒸干氮吹处理，处理液一般只有几毫升，甚至1～2ml或更少。对于这么少的液体，如不认真操作，小心移取，很可能会引起液体的喷、溅、洒、漏现象；即使只有几滴，也足以引起宝贵的痕量组分损失，对检测结果造成较大影响。样品或试液粘壁，提取不完全，也能引起检测成分损失。

痕量组分遭受污染的后果更严重。它与常量成分相比实在是太渺小了，即使被污染一小滴，也足以对痕量检测结果造成巨大影响。污染待测药物会使检测结果成倍提高或呈几何级变化；污染其他化学药物会引入不明杂峰，影响分离度，干扰检测主峰；误加或污染了检测中的其他溶液，会破坏药物定量反应，使痕量组分得不到有效萃取，使杂质成分得不到良好分离，甚至还会掩蔽痕量组分，使之不能转化为所需要的检测形式；操作不当还容易引起样品间的交叉污染。

残留检测操作繁琐、步骤冗长，从样品制备、器皿洗洗，到整个前处理与仪器检测过程都容易发生污染、误操作。这就要求我们在检测时不仅要认真谨慎、精耕细作，还要遵守痕量分析的有关规则和程序。首先要严格遵守样品制备程序、器具洗涤程序，避免所制样品和所用器具本身就存在污染；配制溶液时都要粘贴标签，使用时仔细查验，避免误用；试液转移中所用的离心管、试管等器具必须贴写一致性编号，号对号操作，以免误操作；样液移取中所用的枪头、吸管、滴管、量器也要专用，避免发生交叉污染；各种标准溶液对痕量检测具有高污染风险，凡接触过对照溶液、标准工作液、阳性质控样品的检测器具器皿都要严格区分；试液的均质、转移、浓缩等过程应动作轻缓、谨慎操作，避免因喷溅与暴沸引起损失或污染；对于检测仪器除了要保持良好的性能状态，同样要避免发生污染（如pH计电极、色谱仪器的进样针），应执行《兽药残留实验室质量控制规范》规定的 “仪器进样程序”。还要特别注意，痕量检测要与兽药、饲料等常量检测区域严格隔离，更不能仪器共用。

3 对试剂与耗材进行筛选

3.1 化学试剂

由于试剂级别不同、提纯和精制工艺差异，化学试剂中常含有不同种类、不同含量的杂质存在。这些杂质对常量检测也许影响不大，但对痕量检测会产生很大影响；尤其是试剂级别低的试剂，杂质含量多、紫外吸收强，不仅提高基线噪声降低检测灵敏度，还会干扰检测主峰。含有强极性物质或固体微粒时，能吸附、缔合色谱柱填料，引起柱分离性能变异，造成色谱峰峰形扩展、拖尾或双峰等，甚至会阻塞柱头、柱筛板和色谱系统设计很细的管路系统，引起柱压升高或仪器损坏。

3.2 检测耗材

随着药物残留检测工作的普遍开展，商品化的塑料离心管、滴管、枪头、滤膜等耗材得到大量运用。然而，这类耗材品种繁多、性质各异，稳定性不强，并在检测中还要时常遭受甲醇、丙酮、烷烃等多种有机溶剂的浸泡，酸碱作用、含盐流动相的腐蚀，及光照、温度、高速离心力的影响，难免会产生对检测有干扰的物质；许多增塑剂、抗氧化剂在高温或酸性条件下释放有机质，在甲醇、乙醇等试剂中溶解，影响检测结果；尼龙、橡胶等高分子材料化学还原改性后具有静电作用，可对某些检测成分产生吸附。

因此，在检验时要对所用试剂和耗材仔细筛选、验证，保证每次检测使用合格的材料。对于对检测结果有显著影响的试剂耗材、标准物质、固相萃取柱等关键材料，要通过反复实验固定品牌、来源渠道和供应商，变更时需重新验证。

4 固相萃取柱

阳性添加回收率用来衡量残留检测的准确度，并常用于实验室质控。回收率一般规定应为80%～110%或60%～120%，其结果受多种因素影响，其中影响最大的是固相萃取柱。

畜禽样品的固相萃取过程较为复杂，萃取效率取决于药物性质、样品基质和固相萃取柱填料3者之间的相互作用。在给定检测标准前两者确定的情况下，固相萃取柱的优选很关键，关系着萃取效率的优劣，关系回收率的好坏。通过重新调整方法、优化萃取液比例，也可以得到较好的回收率结果，但这样做起来往往很麻烦。

目前市售固相萃取柱的公司很多，各种小柱的填料成分、理化性质、加工工艺存在很大差异，同一品牌批次之间也会有差别，如果不加筛选、验证，随意买上就用，回收率肯定不佳。

验证方法是每批购买回来后，要先测试3～6支的柱回收率：以一定量的标准工作液代替试样溶液测定回收率，柱回收率达到约90%时符合要求。如果柱回收率本身不高，再扣除其他步骤的损失，检测样品的回收率很难达到标准要求。

5 标准物质要进行纯度折算

兽药残留检测涉及的药物多种多样，包括常用兽药，也包括不常用兽药、淘汰兽药和违禁药物，还包括一些农药、人用药和非药物成分（如三聚氰胺），有时还需检测药物代谢产物、同系物和同分异构体等[1]，这给标准物质的获得带来困难。有的药物结构复杂，量产困难，很难购得；有的药物不稳定，只能以盐的形式存在；还有的药物含结晶水或其他成分，与要求的检测形式不一致，要想得到像普通化学检验那样的基准物质很不现实。好在兽药残留属于限量判定，实验精密度要求不太高，在保证量值溯源、实验室验证的前提下，可以使用纯度较高、主药成分相同的同类标准物质代替[2]。但要注意，应根据检测成分来选择适合的标准物质，化学成分应与检测药物相同，不一致时必须进行纯度折算，否则会造成标准溶液浓度偏高。

多数对照品标明化学纯度，可以直接代入计算；有的含有少量水分和杂质，要根据有证标准物质信息或说明书规定的方法扣除；含结晶水、盐基或特殊基团时，应查阅分子量信息和分子结构式，将其换算为检测成分的纯度。如检测环丙沙星（分子式C17H18FN3O3，分子量331.34），若使用对照品盐酸环丙沙星（分子式C17H18FN3O3·HCl，分子量367.80，纯度94.0%），其纯度应折算为复杂一点的还要考虑药物的分子结构，如测定内酰胺类中的青霉素G（分子式C16H18N2O4S，分子量334.39），而可得到的对照品是苄星青霉素G4水合物（分子式C48H56N6O8S2·4H2O，分子量981.18，纯度97.2%）； 分析C48H56N6O8S2·4H2O的结构式应为 (C16H18N2O4S)2·C16H20N2·4H2O，含两分子的青霉素G、一分子的N，N-二邻甲苯基乙二胺和四分子结晶水，则对照品实际纯度应为97.2%×