鱼皮胶原蛋白提取二肽基肽酶-IV抑制剂研究进展

文/赖孟瑄 张金兰 武瑞赟 李平兰

胶原蛋白是多细胞生物中含量最丰富、分布最广泛的蛋白质种类之一。传统的天然胶原蛋白主要来自于哺乳动物的皮肤和跟腱组织。但是，由于人畜共患疾病，哺乳动物来源的胶原蛋白生物安全性受到消费者的质疑。近年来，水生胶原，尤其是鱼类胶原日益受到研究者的重视。中国是世界渔业大国，不仅拥有广阔的水域面积，而且鱼类资源极为丰富，这为鱼源胶原蛋白研究开发提供了充足的原料。目前，由于鱼类加工和综合利用技术不够成熟，在鱼类加工过程中产生的副产物，如鱼皮、鱼骨、鱼鳞、鱼内脏等，都尚待深入开发和研究利用。鱼皮中富含胶原蛋白，为天然优质胶原蛋白的提取原料。近年来的研究发现，通过提取鱼皮中的胶原蛋白成分，可以制备如二肽基肽酶-IV（DPP-IV）抑制剂、抗氧化肽、血管紧张素抑制剂等功能性的产品。

一、 DPP-IV抑制剂的研究

目前，以胰高血糖素样肽-1（GLP-1）为靶点的II型糖尿病治疗方案日益受到欢迎。GLP-1不仅可以维持人体内血糖的平衡，还可以诱导前胰岛素基因的转录，促进胰岛素的生物合成和分泌；刺激β细胞增殖和再生、抑制其凋亡，维持β细胞的数量和功能等多个途径和机制共同参与血糖稳态调节。二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase IV，DPP-IV）是位于细胞表面的一种丝氨酸肽酶，其主要作用是优先将氨基末端第2个氨基酸为丙氨酸（Ala）或脯氮酸（Pro）的寡肽的氨基末端的前两个氨基酸剪切去除。

经研究发现天然GLP-1的氨基末端第2个氨基酸为丙氨酸，可被DPP-IV剪切，失去促胰岛素分泌活性。DPP-IV使GLP-1失活的作用快速而不可逆，使得天然产生的活性GLP-1半寿期极短（<2 min）。因此DPP-IV抑制剂成为目前糖尿病治疗药物研发的热点。目前的DPP-IV活力临床抑制剂主要包括西格列汀、维格列汀、沙格列汀、阿格列汀、利格列汀等。其中如西格列汀就是作为一种竞争性抑制剂，其通过与DPP-IV高保守的β-螺旋区域谷氨酸残基Glu205和Glu206非共价结合抑制其活性。

化学合成的药物，其副作用成为人们担心的重点，食源性DPP-IV肽类抑制剂的开发为避免毒副作用开辟了新思路。目前对于食源活性肽的DPPIV抑制活性研究也在不断丰富。张颖等人通过酶解提取出了牛、羊乳酪蛋白源DPP-IV抑制肽；王凤等对燕麦多肽进行了研究并对酶解产物进行了提取分析，实验发现燕麦蛋白也是一类良好的DPP-IV活力抑制剂的肽源；吉薇等人利用动物蛋白酶酶解南极磷虾，不仅成功提取出了高抑制率的肽类产品，还进一步对酶解条件等进行了优化并纯化了分离出的短肽产品。因此，以食源蛋白质为原料开发新的DPP-IV抑制剂成为近年来研究的重点。

二、鱼皮与DPP-IV抑制活性的联系

关于鱼皮明胶的研究很多，其中含有丰富氨基酸的肽段，可以作为DPP-IV酶的作用靶点，从而作为竞争性抑制剂来开发应用。目前已有很多研究以鱼皮为原料提取的DPP-IV抑制剂。

Cheung I W Y等人利用不同的酶酶解虹鳟鱼来提取胶原蛋白，并用提取的产物对DPP-IV活力抑制效果进行了实验，列出了DPP-IV抑制活力较好的酶解条件和使用的酶种类。陈孟君等人以比目鱼、吴郭鱼、虱目鱼鱼皮明胶为原料，也分离出了有DPP-IV抑制活力的明胶产物。Wang等人通过实验，也测定了大比目鱼皮水解产物和罗非鱼皮肤明胶水解产物获得的<1.5 kDa超滤级分，体外显示的DPPIV抑制活性并且将它们用于体内抗高血糖试验。结果表明富含亚氨酸的温水鱼皮明胶具有DPP-IV抑制活性，可用于改善前驱糖尿病的潜力。杨玲等人在对鲟鱼鱼皮明胶提取和功能性分析的实验中发现，鲟鱼皮中富含Pro、Ala、Hyp，而DPP-IV主要活性作用就是优先将氨基末端第2个氨基酸为丙氨酸（Ala）或脯氮酸（Pro）的寡肽切除。由于鲟鱼皮中存在这类丰富的氨基端，因此潜在的具有这种末端形式的肽段会十分丰富。所以，以鲟鱼鱼皮胶原蛋白为原料生产DPP-IV抑制剂，作为一类竞争性抑制剂发挥功效，有很高的潜力和研究价值，值得进一步的深入研究。

三、酶解鱼皮制备DPP-IV活力抑制剂的探究

在不同的鱼皮酶解实验中，都使用了一种或多种酶进行酶解。付余等人在对鲑鱼皮进行水解时主要选择了碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶。在何娟等对鲢鱼皮的水解实验中，除了以上这几种酶以外，还选择了风味蛋白酶以及胰蛋白酶。庄永亮等在对罗非鱼的酶解实验中除了分别利用碱性蛋白酶和中性蛋白酶以外，还添加了两者复合水解的条件。程波等人在酶法提取鲟鱼皮中胶原蛋白的实验里则是选择了胃蛋白酶进行实验。上文提到的Cheung I W Y等人，在酶解虹鳟鱼皮时使用了胃蛋白酶/Corolase N以及木瓜蛋白酶，其研究发现酶的不同选择以及组合的方式的抑制效果有所不同，首先对单一酶的水解程度和抑制能力进行评估，再筛选出合适的浓度以及酶解时间条件进一步对酶的种类进行组合，达到多种酶复合连续作用的效果，使产物的抑制率得到提高。

酶解条件的选择，是探究酶解胶原蛋白的相关实验中极为重要的组成部分。在酶解鱼皮制备DPP-IV活力抑制剂的实验中，酶解的pH、酶解的温度和时间以及酶的添加量都会对最终产品的抑制能力大小产生影响。以王小军等人所做的有关鳀鱼蛋白酶解条件响应面优化为例来看，一个完整的酶解过程应该从设计单因素实验开始，探索不同酶解条件对水解程度以及产品DPP-IV活力抑制的能力，从而逐层优化出有效果的酶解条件。在此条件下，进一步通过响应面实验等构建模型得到优化后的酶解工艺条件。

四、功能性鱼粉产品加工的探究

确定酶使用的种类以及酶解条件得到DPP-IV抑制肽，是开发鱼皮活性肽产品的基础。为了进一步生产和制作出食品级的、具有DPP-IV抑制活力的鱼粉产品，还需要对进一步探索产品的加工和复配。于东等人对胶原蛋白粉研究发现，胶原蛋白粉加工方面主要涉及的流程包括胶原蛋白的提取、烘干制粉等关键步骤，过程中应注意温度的控制以及微生物的控制，防止出现污染和破坏。余宙等人在制备鱼胶原蛋白粉的研究中，主要利用浓缩和喷雾干燥来生产，涉及到浓缩时的温度和压力、干燥时进口和出口温度的选择。程波等人在提取鲟鱼皮胶原蛋白，选择先利用酶浸提出所需的胶原蛋白成分，再进一步利用氯化钠盐析、进一步透析干燥得到成品。值得注意的是，王国强等制取长鳍金枪鱼鱼皮胶原蛋白肽的工艺探究中，还用到了到活性碳脱色。

除了以上讨论的方面，值得进一步优化的鱼粉生产加工方面还有很多。除了产品加工条件有待探究以外，如何对鱼粉复配从而在达到抑制效果的同时被更多人所接受也是值得研究的方向。胡从玉等人在制备具有养胃健脾功效的功能性鮰鱼粉产品时，就利用了中药中开发利用具有健脾养胃功效的辅助产品，如山楂、葛根等。因此，在设计功能性鲟鱼粉时，复配功能性的辅助成分，不仅会对产品在风味上加以补充，同时还在功效上得以对产品进一步完善。

五、思考与展望

近年来，糖尿病发病率及患病率随着人类生活方式的改变、人口老龄化进程的加快而逐年增长。根据国际糖尿病联盟最新数据显示，2017年糖尿病患病率（20岁～79岁）估计为8.8%，2045年预计会达到9.9%。我国糖尿病患者数已达1.096亿，居全球首位。因此有效的控制、诊断、管理和教育对糖尿病患者来说十分重要。近些年，有关糖尿病的研究得到不断发展，抗II型糖尿病的药物和功能性产品也在不断发展。开发天然的II型糖尿病抑制剂，可以有效的控制病情发展，同时进一步促进食品工业的发展。

中国是世界上鱼类品种最多、分布最广、资源最为丰富的国家之一。鱼类深加工后的主要副产物—鱼皮和鱼骨中均富含胶原蛋白，可作为天然优质胶原蛋白来提取原料，有很好的研究和开发前景。DPP-IV抑制剂作为II型糖尿病的一种新型疗法，是很有潜力的研究领域，与鱼类副产物特性相结合，值得继续开发。