HPLC-MS/MS法测定桑菊感冒丸中3种成分的含量

刘世军，孙克明，刘宪勇，张敏，谷雨，王岩，毕文超，魏玮（.武警山东省总队医院药剂科，济南25004；2.解放军第8医院，南京 20002）

桑菊感冒丸是源自清代名医吴瑭的“桑菊饮”经现代工艺加工而成的中成药制剂[1]，由桑叶、菊花、连翘、薄荷素油、苦杏仁、桔梗、甘草、芦根等八味药组成[2-5]，临床上多用于风热感冒、上呼吸道感染、流行性结膜炎、麻疹、流感等外感热病初起，邪气轻浅发热不重等症的治疗。该药疗效显著、价格实惠、副作用小，在临床应用非常广泛，因此建立一个全面的标准对其质量控制显得尤为重要。桑菊感冒丸的现行标准中，2015年版《中国药典》（一部）只对连翘苷的含量进行了控制[6]；另有文献报道采用高效液相色谱（HPLC）-紫外分光光度法（UV）[7-10]、HPLC-蒸发光散射检测法（ELSD）[11]等方法对类似制剂有效成分进行检测[8-12]。但上述各方法存在灵敏度低、分离效果不佳、专属性差等缺点，用以检测成分复杂的中成药结果差异较大。近年来，HPLC-串联质谱法（HPLC-MS/MS）以其专属性强、灵敏度高等优势在中药有效成分含量测定中应用日益广泛[13-15]。本试验采用HPLC-MS/MS法同时测定桑菊感冒丸中芦丁、连翘苷、桔梗皂苷D的含量，旨在为其全面质量评价提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器

1200型HPLC仪-6460型三重四极杆MS仪，包括电喷雾离子源（ESI）、B.05.00 Masshunter色谱工作站（美国Agilent公司）；BP 211D型电子分析天平（德国Satorius公司，精密度：0.01 mg）；LC-600B型数控超声波仪（济宁鲁超超声设备有限公司）。

1.2 药品与试剂

桑菊感冒丸（四川某药厂，批号：2016041、2016042、2016043，规格：15 g/100粒）；芦丁对照品（批号：100080-201409，纯度：91.9%）、连翘苷对照品（批号：110821-201514，纯度：93.5%）、桔梗皂苷D对照品（批号：111851-201406，纯度：96.2%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 试验条件

2.1.1 色谱条件色谱柱：Waters Atlantis C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脱（0～3 min，20%A；3～15 min，20%→60%A；15～23 min，60%A；23～24 min，60%→20%A；24～30 min，20%A）；流速：0.2 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。

2.1.2 质谱条件 离子源：ESI；干燥气和雾化气：高纯氮气；干燥气温度：270℃；干燥气流量：25 L/min；鞘气流量：10 L/min；毛细管电压：4 500 V；喷嘴电压：2 000 V；扫描模式：多反应监测（MRM）；检测模式：正离子；扫描时间：0.1 s。质谱参数见表1。

表1 质谱参数Tab 1 Mass parameters

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取芦丁、连翘苷、桔梗皂苷D对照品各10 mg，分别置于10 mL量瓶中，加60%甲醇溶液溶解并定容，即得单一对照品贮备液。精密量取上述单一对照品贮备液各2 mL，置于同一100 mL量瓶中，加60%甲醇溶液稀释，摇匀，即得混合对照品贮备液。精密量取上述混合对照品贮备液1 mL，置于50 mL量瓶中，加60%甲醇定容，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 取样品100粒，研细，精密称取细粉0.25 g，置于具塞锥形瓶中，精密加60%甲醇溶液50 mL，称定质量，超声（功率：100 W，频率：35 kHz）提取30 min，静置至室温，再次称定质量，用60%甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，精密量取上清液10 mL，置于50 mL量瓶中，加60%甲醇溶液定容，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 按桑菊感冒丸处方和工艺制备分别缺芦丁、连翘苷和桔梗皂苷D的阴性样品，并按“2.2.2”项下方法制成阴性对照溶液。

2.3 专属性试验

取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各适量，按“2.1”项下试验条件进样分析，记录提取离子流色谱图，详见图1。结果表明，3种待测成分可被同时检测，且阴性对照均未在各待测成分相应出峰位置检测到干扰成分，专属性良好。

2.4 线性关系考察

图1 提取离子流色谱图Fig 1 Extraction ion chromatogram

分别精密量取“2.2.2”项下混合对照品溶液0.1、0.4、2、4、10、20 mL，分别置于200 mL量瓶中，加60%甲醇溶液定容，制成系列混合对照品溶液。精密量取上述系列混合对照品溶液各10 μL，按“2.1”项下试验条件进样测定，记录峰面积。以待测成分质量浓度（x，ng/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归。回归方程与线性关系见表2。

表2 回归方程与线性关系Tab 2 Regression equations and linear ranges

2.5 定量限与检测限考察

分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，并按“2.1”项下试验条件进样测定，当信噪比为10∶1时，得定量限；当信噪比为3∶1时，得检测限。结果，芦丁、连翘苷、桔梗皂苷D定量限分别为1.250、0.260、2.720 ng/mL，检测限分别为 0.380、0.078、0.820 ng/mL。

2.6 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下试验条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，芦丁、连翘苷、桔梗皂苷D峰面积的RSD分别为1.05%、0.57%、1.00%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：2016041）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、12 h时按“2.1”项下试验条件进样测定，记录峰面积。结果，芦丁、连翘苷、桔梗皂苷D峰面积的RSD分别为1.80%、2.50%、1.20%（n＝5），表明供试品溶液室温放置12 h内基本稳定。

2.8 重复性试验

精密称取样品（批号：2016041）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下试验条件进样测定，记录色谱并计算含量。结果，芦丁、连翘苷、桔梗皂苷D含量平均值分别为260.5、184.8、169.3 μg/g，RSD分别为0.82%、1.10%、0.99%，表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收试验

取已知含量样品（批号：2016041）适量，共6份，分别加入一定质量的待测成分对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下试验条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表3。

表3 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 3Results of recovery tests（n＝6）

2.10 样品含量测定

取3批样品各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下试验条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表4。

表4 样品含量测定结果（n＝3，μg/g）Tab 4Results of sample determination（n＝3，μg/g）

3 讨论

3.1 流动相的选择

在预试验中笔者考察了乙腈、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-10 mmol/L醋酸铵溶液为流动相时的色谱图形，结果表明，流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液时可得较好的峰形和分离度。

3.2 提取方法的选择

笔者考察了乙醇、75%乙醇溶液、100%甲醇溶液、60%甲醇溶液、20%甲醇、水为提取溶剂时的提取效果。结果表明，60%甲醇溶液提取效果最好。同时，还比较了超声和回流提取方法的效果，结果2种方法效果相近，所以选择较为简单的超声提取法。笔者也对超声时间进行了考察，结果表明，超声30 min时效率最高，超过30 min后各成分含量趋于平稳。

3.3 质谱参数的选择

在对质谱条件进行优化时，分别考察了干燥器和鞘气的流量、毛细管电压、喷嘴电压等参数对含量测定的影响，最终确定文中试验条件为最优条件。本试验采用MRM模式对样品进行扫描，因此母离子和子离子的确定尤为重要。在确定母离子后，选择最佳的碎裂电压和碰撞能量，同时将信号响应最强最稳定的子离子作为定量离子，得到稳定提取离子流色谱图，为样品的定量提供数据支持。

综上所述，本方法操作简便，精密度、稳定性、重复性好，可用于桑菊感冒丸中芦丁、连翘苷和桔梗皂苷D含量的同时测定。

[1]吴瑭.温病条辨[M].北京：中国中医药出版社，2006：90-97.

[2]姚静，张超.桑菊感冒合剂提取工艺的研究[J].中国医药指南，2014，12（25）：96-97.

[3]杨周贇.桑菊饮化裁治疗春季感冒后咳嗽30例[J].北方药学，2013，10（7）：47.

[4]孙立艳.桑菊感冒片生产工艺改进[D].天津：天津大学，2013.

[5]韦春燕.桑菊饮加减治疗妊娠期感冒26例[J].中国民族民间医药，2010，19（17）：173.

[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：1463-1464.

[7]袁才琼，邱海蕴，康红英.高效液相色谱法测定桑菊感冒片中绿原酸的含量[J].中国医院药学杂志，2010，30（4）：348-349.

[8]刘志武.高效液相色谱法同时测定桑菊感冒片中连翘苷和甘草苷含量[J].医药导报，2008，27（7）：855-856.

[9]张雷，何兵.HPLC测定桑菊感冒片中绿原酸的含量[J].现代医药卫生，2007，23（16）：2379-2381.

[10]李洁，吴政然.高效液相色谱法测定桑菊感冒片中连翘苷的含量[J].实用中医内科杂志，2006，20（3）：250-251.

[11]丁大勇，高菲，姚琳，等.HPLC-ELSD法测定桑菊感冒片中桔梗皂苷D的含量[J].中国中医药信息杂志，2012，19（3）：54-55.

[12]孙志，胡玉荣，左莉华，等.UPLC-MS/MS法同时测定复方血栓通胶囊中9种成分的含量[J].中国药房，2017，28（21）：2959-2963.

[13]李霄，吴茵，支旭然，等.UPLC-MS/MS法同时测定苦黄注射液中7种成分的含量[J].中国药房，2017，28（15）：2108-2112.

[14]赵振霞，王敏，王钰宁，等.UPLC-MS/MS法测定心可舒胶囊中5种皂苷类成分的含量[J].药物分析杂志，2016，36（3）：494-499.

[15]史贺，张巧月，杨浩天，等.HPLC-MS/MS法同时测定健胃消食片中8种化学成分的含量[J].药物分析杂志，2015，35（9）：1606-1611.