正交试验优化头孢噻肟钠原料药有关物质检查中溶液制备条件

2018-01-18张涛豆东海杨鹏波安阳市食品药品检验检测中心河南安阳455000河南康达制药有限公司河南周口46600

中国药房 2017年36期

张涛，豆东海，杨鹏波（.安阳市食品药品检验检测中心，河南安阳455000；.河南康达制药有限公司，河南周口 46600）

头孢噻肟钠属于第三代头孢菌素类衍生物，对革兰氏阴性菌的抗菌活性高于第一代和第二代，因其耐酶和广谱的特点而在临床上广泛使用[1]，其质量标准收载于2015年版《中国药典》（二部）[2]。笔者依照《中国药典》检验标准对头孢噻肟钠原料药进行质量分析时，发现有关物质检查重复性较差，结果不稳定。笔者参考相关文献[3-6]，发现放置时间、放置温度、磷酸盐缓冲液pH、光照这4个因素均对溶液稳定性有较大影响，单因素考察试验显示随着供试品溶液放置时间增加、试验温度提高、磷酸盐缓冲液pH增加、光照强度增加这些因素的改变，头孢噻肟钠原料药杂质总量会变化；但未见有综合上述4个因素进行影响分析的报道。鉴于此，笔者采用单因素和正交试验法，以该原料药中的杂质总量为指标，优化有关物质检查中溶液的制备条件，以期为完善该原料药有关物质检查方法提供参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-2030C型高效液相色谱（HPLC）仪，包括自动进样器、柱温箱、紫外检测器（日本Shimadzu公司）；MS105DU型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；HYC-390 2～8℃海尔医用冷藏箱（青岛海尔公司）；Labonce-380GS 4～65℃恒温箱（北京兰贝石恒温技术有限公司）；Milli-Q Advantage A10型超纯水仪（美国Millipore公司）。

1.2 药品与试剂

头孢噻肟钠原料药（河南某制药厂，批号：201160701、201160702、201160703）；头孢噻肟系统适用性对照品（中国食品药品检定研究院，批号：130619-201402）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为实验室纯化水。

2 方法与结果

2.1 头孢噻肟钠有关物质检查

2.1.1 色谱条件的确定色谱柱：Hypersil ODS2（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：流动相A为0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（取7.1 g无水磷酸氢二钠至1 000 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，用磷酸调节pH为6.50）-甲醇（86∶14，V/V），流动相B为0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（用磷酸调节pH为6.50）-甲醇（60∶40，V/V）；进样时，均先以流动相A-B（95∶5，V/V）等度洗脱，待头孢噻肟峰洗脱完毕后再进行梯度洗脱（梯度洗脱程序：0～2 min，95%→75%A；3～8 min，75%A；9～23 min，75%→0 A；24～28 min，0 A；29～33 min，0→95%A；34～43 min，95%A）；检测波长：235 nm；柱温：5 ℃；进样量：10 μL。

2.1.2 溶液的制备 ①供试品溶液。取样品原料药25.10 mg，置于25 mL棕色量瓶中，用置于冰箱中降温到5℃的流动相A为溶剂进行溶解并定容。溶解过程中，应避光操作，供试品溶液温度应尽量保持5℃。②系统适用性对照品溶液。取头孢噻肟系统适用性对照品25.14 mg，置于25 mL棕色量瓶中，用置于冰箱中降温到5℃的流动相A为溶剂进行溶解并定容，即得。③空白溶液。取空白溶剂适量为空白溶液。

2.1.3 系统适用性试验取“2.1.2”项下溶液各适量，按上述色谱条件进样分析，结果主峰与各杂质峰、各杂质峰间均能达到基线分离，分离度均＞1.5，色谱见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 单因素试验

2.2.1 放置时间取“2.1.2”项下供试品溶液（批号：201160701）适量，分别于放置5、30 、60、120 、240 min时按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，放置时间与杂质总量的关系见图2。由图2可知，杂质总量随着时间的递增呈上升趋势，但在60 min后杂质总量增加变平缓，所以取5、30、60 min为考察因素。

图2 放置时间Fig 2 Standing time

2.2.2 放置温度取“2.1.2”项下供试品溶液（批号：201160701）适量，分别放置于5、15、25、35、45 ℃环境中，各按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，放置温度与杂质总量的关系见图3。由图3可知，杂质总量随着放置温度的增加呈上升趋势，但在35℃以后杂质总量增加变平缓，所以取5、15、30℃为考察因素。

图3 放置温度Fig 3 Placing temperature

2.2.3 磷酸盐缓冲液pH 精密称取样品原料药（批号：201160701）适量，按2015年《中国药典》（二部）[2]现行质量标准有关物质检查项操作制成单因素试验溶液，流动相A为0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（取7.1 g无水磷酸氢二钠至1 000 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，用磷酸分别调节pH为6.0、6.25、6.5、7.0、7.25）-甲醇（86∶14，V/V）；流动相B为0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（用磷酸分别调节 pH 为 6.00、6.25、6.50、7.00、7.25）-甲醇（60∶40，V/V），供试品溶液中磷酸盐缓冲液的pH也相应变化；检测波长：235 nm；试验环境及样品温度：25℃；进样量：10 μL。并按“2.1.1”项下梯度洗脱程序进行梯度洗脱，按上述条件测定杂质总量，结果见图4。由图4可知，当磷酸盐缓冲液pH为6.00～7.25时，杂质总量降低，但考虑到甲醇也呈碱性，所以流动相A和B混合后流动相pH会接近8，达到了常规色谱柱的高限，所以取pH为6.0、6.25、6.5为考察因素。

图4 磷酸盐缓冲液pHFig 4 pH value of phosphate buffer solution

2.2.4 光照条件分别在避光环境下（1）、棕色量瓶（2）、正常环境（3）下，按“2.1.2”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液（批号：201160701），再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，光照条件与杂质总量的关系见图5。由图5可知，杂质总量随着光照强度的增强呈上升趋势。所以取避光环境、棕色量瓶、正常环境为考察因素。

图5 光照条件Fig 5 Illumination condition

2.3 正交试验

2.3.1 正交试验设计在单因素试验的基础上，以头孢噻肟钠含量（%）为指标，对磷酸盐缓冲液pH（A）、放置温度（环境温度及溶液制备时温度）（B）、供试品溶液从制备完成到进样前的放置时间（C）以及光照条件（D）4个因素进行考察，各因素均取3个水平（见表1），L（934）正交试验设计与结果见表2（表中杂质总峰面积＝总峰面积－主峰面积）；方差分析结果见表3。