基于近红外显微成像的豆粕和抗生素菌渣鉴别分析

杨增玲 林玉飞 梁 浩 李守学， 肖志明 樊 霞

(1.中国农业大学工学院， 北京 100083； 2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所， 北京 100081)

引言

目前，我国已经成为世界上最大的抗生素生产国[1]。在抗生素生产过程中，大量抗生素菌渣(也称药渣、滤渣)随之产生。抗生素菌渣中主要成分是微生物菌丝体、培养基残渣及其他一些未完全代谢利用的有机物，其粗蛋白含量较高[2-3]，基本接近常用的蛋白质饲料原料[4]。20世纪90年代，国内尝试过将其进行无害化处理后生产蛋白质饲料，出现试图直接利用抗生素菌渣作为饲料或饲料添加剂使用的现象[5-8]。但对于抗生素菌渣的利用，由于其未进行充分的安全性评价，并存在诱导细菌耐药性的风险，因此所有种类抗生素滤渣在2002年被列入《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》[9]，2008年被列入《国家危险废物名录》[10]。养殖过程使用含有抗生素菌渣的饲料具有以下潜在隐患：抗生素菌渣中含有残留的抗生素，长期饲喂动物后造成抗生素在肉、蛋、奶等畜禽产品中残留，诱发食品安全问题；抗生素菌渣中含有抗生素培养过程中产生的未知成分中间产物，在没有确定安全性之前，将其作为蛋白质饲料原料应用于饲料生产中存在潜在风险；长期低剂量食用抗生素将会增加抗生素与动物体内细菌的接触机会和时间，使细菌适应了抗生素的环境，逐渐产生耐药性。因此，研究饲料中抗生素菌渣的鉴别分析技术对于保障饲料安全、食品安全乃至人类健康具有重要意义。

由于抗生素菌渣中的主要成分含量与饲料中的部分基础营养成分比较相近[11]，尤其是蛋白饲料中的蛋白含量[5]，仅通过常规的成分检测很难辨别。目前可查阅到的检测方法多为通过化学手段[12]或标志物指示手段[13]检测饲料中的抗生素残留来评估饲料中是否添加抗生素菌渣，但是这些方法操作繁琐、成本高、试验周期长，且需要提前知道目标检测物，而抗生素菌渣品种繁多，性质各异，仅依靠化学或标志物指示的方法难以满足饲料大规模检测的要求。目前，国内外对饲料中是否添加使用抗生素菌渣的检测方法研究存在欠缺，尤其是快速便捷的检测技术，难以适应饲料工业和养殖业的发展需要。因此，需要探索一种便捷、高效、无损的检测方法准确鉴别饲料中的抗生素菌渣。

近红外光谱已被广泛应用于异常分析[14]，而近红外显微成像技术则扩展了传统近红外光谱的描述范围，具有更高灵敏度，能够获取样品在微区上的信息，增强了对样品内部异质组分的分析能力[15-16]，因此可以提高检测分析效率，减少样本分析量。抗生素菌渣化学成分复杂，近红外特征峰重叠严重，单一谱峰很难将其与蛋白饲料区分开来，需要结合多元判别分析方法，构建监督校正模型，才能相对准确地对样品光谱定性判别。

本文主要利用傅里叶变换近红外显微成像系统，采集豆粕与抗生素菌渣样品的可见光图像和近红外图像，利用Duplex算法从样品光谱中挑选具代表性光谱分别建立抗生素菌渣光谱库和豆粕光谱库，基于光谱库结合偏最小二乘判别分析(Partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)和支持向量机判别分析(Support vector machine discriminant analysis，SVM-DA)定性判别分析方法，建立豆粕和不同种类抗生素菌渣的定性判别分析模型，探究利用近红外显微成像技术对二者鉴别分析的可行性。

1 材料与方法

1.1 样品采集与样品制备

试验所用3种抗生素菌渣均采集于福建省不同的抗生素生产厂家，分别为硫酸链霉素菌渣、土霉素菌渣、硫酸粘杆菌素菌渣，所收样品均为湿菌渣。湿菌渣易变质，不易保存，因此统一将所有收到的湿菌渣样品放置在空气中自然晾晒风干，然后置于105℃的干燥箱中干燥24 h，密封保存备用。收集不同产地的豆粕样品3个，其产地及其常规化学指标如表1所示，3种豆粕的含水率以及粗脂肪、粗蛋白含量非常相近。

所有样品经粉碎后过0.5 mm分析筛，使所有样品粒度在0.5 mm以下，密封包装，贮存于4℃药品冷藏箱中。试验前取出样品，回温放至室温(20℃)。

表1 3种豆粕的产地及常规化学指标Tab.1 Origin and conventional chemical indexesof three kinds of soybean meal

1.2 近红外显微图像获取

采用Spotlight 400型傅里叶近红外显微成像系统(美国Perkins Elmer公司)采集样品的近红外显微图像，针对样品特点和近红外显微图像扫描，设置图像采集参数如下：光谱波数范围为7 800～4 000 cm-1，光谱分辨率为32 cm-1，扫描次数为8次，空间分辨率为25 μm×25 μm，干涉仪动镜移动速度为1 cm/s，图像扫描面积为5 000 μm×5 000 μm。图像采集软件为Spectrum IMAGE。

分别将豆粕和抗生素菌渣样品平铺在聚四氟乙烯样品板上，样品厚度约为1 mm，以相同的聚四氟乙烯样品板作为参比板，逐一采集样品光谱。扫描过程中检测室内冲高纯氮进行空气校正，以减少水蒸气和二氧化碳造成的光谱吸收。

1.3 数据处理

近红外显微成像系统采集到的图像为三维数据，图像上的每个像素点代表一条光谱，图像经过重组成为二维的光谱。本试验所收集到的图像为200×200×239，经重组展开为40 000×239的光谱矩阵。

为消除获取近红外光谱图像过程中所产生噪声信号对定性判别模型的影响，需要合理选取光谱预处理方法。通过近红外显微图像获取的样品的近红外漫反射光谱存在基线漂移现象，光谱在小范围内存在较多的噪声信号。对于基线漂移问题的有效预处理方法是求导数，对于样品颗粒大小不均匀、表面散射及光程变化等问题的有效处理方法是标准正态变量变换(Standard normal variate transformation, SNV)。

由于近红外显微成像技术的特点，微区采集到的光谱存在很多信息一致的重复光谱，且光谱的数据量巨大。本试验中所获取的每幅近红外显微图像中包括40 000条光谱。为减少计算量，且保证光谱代表性，本试验利用Duplex算法[17-18]选取具有代表性的光谱用于模型建立和独立验证。Duplex算法的主要目标是在备选数据集合中选择2个具有代表性的相似子数据集，所选出的2个数据集合具有相似的数据分布、性质。首先对备选数据集进行标准化和正交归一化，求出各数据点之间的欧氏距离，将距离最远的2个点放入第1个样本集，然后将剩余样品中距离最大的2个点放入第2个样品集，重复以上步骤直至选到设定代表样品数目。通过此算法分别获得豆粕和抗生素菌渣样品的光谱库。

豆粕和3种菌渣的成分差异较小，而光谱存在微小差异，若要更具体地说明豆粕和抗生素菌渣光谱的这些微小差异仅通过简单的差异性分析难以辨别，为此，本文使用皮尔逊相关系数计算豆粕和3种抗生素菌渣的光谱相似性。皮尔逊相关系数的计算公式为

(1)

式中K(x，y)——皮尔逊相关系数

x、y——待测样本光谱

K值越接近1，2条光谱的相似性越大，越接近0则差异性越大。

基于样品光谱库光谱，分别采用PLS-DA和SVM-DA方法建立定性分析模型对豆粕和不同种类抗生素菌渣进行鉴别分析。

偏最小二乘法(Partial least squares，PLS)[19]是基于对矩阵X和Y进行分解消除噪声信号而提出的多元因子回归方法。在对X和Y分解的同时，将Y的信息引入到X矩阵分解过程中，使得X的主成分直接与Y关联，在考虑主成分方差尽可能大的同时，还使主成分与Y最大程度地相关，目的是尽可能利用光谱变量与浓度之间的线性关系。PLS-DA模型[20]是基于PLS的判别分析，以Y变量为二进制变量(类别变量)取代浓度变量，计算光谱矩阵X与类别矩阵Y的相关关系，取得X与Y的最大协方差Cov(X，Y)。

支持向量机(Support vector machine，SVM)[19，21]用于处理分类问题，找出距区分类别最大相位的超平面，以确保分类错误率为最小。SVM分类法的核心思想是：通过线性或非线性映射(核函数)，将输入空间映射到高维特征空间，也将非线性问题通过核函数映射到高维空间转换为线性问题，然后在高维特征空间中构造最优(线性)分类平面对数据进行分类。常用的核函数有线性函数、多项式函数、径向基函数(Radial basis function，RBF)、层感知核函数等[19]，其中RBF计算量小，具有良好的学习能力。本研究采用nu-SVC算法，选择非线性Gaussian-RBF核函数进行SVM-DA模型构建。在将原始数据映射到高维特征空间后，虽然转换成线性数据，但是引入了一些冗余信息，为了在确保模型准确的基础上尽量减小数据量、简化计算过程[22-25]，需要对高维空间的线性数据进行特征提取。常用的特征提取方法有PLS和主成分分析(Principal component analysis，PCA)，经模型验证使用PLS特征提取所建模型比PCA效果好，因此本研究所建模型均采用PLS特征提取。

本文中所有数据处理与分析在Matlab R2013a(美国Mathworks公司)平台中实现，其中PCA、PLS-DA及SVM-DA使用PLS_toolbox(美国Eigenvector公司)实现。

2 结果与分析

2.1 豆粕和抗生素菌渣近红外光谱特性分析

图3 豆粕和3种抗生素菌渣的近红外平均光谱及其二阶导数光谱Fig.3 Near-infrared average spectra of soybean meal and three antibiotic mycelial residues and their second derivative spectra

图1为3种抗生素菌渣和豆粕的近红外显微图像，图像均为Matlab处理后的重构图像。将三维的近红外显微图像光谱进行分解，可得到每个样品的所有光谱。图2为3种豆粕光谱和这3种豆粕的平均光谱，由图2可知3个豆粕样品光谱的吸光度及光谱形状几乎一致，且相关系数达到0.990以上，因此将3个豆粕样品的平均光谱作为豆粕样品的光谱，分析与不同抗生素菌渣光谱之间的差异。

图1 豆粕和3种抗生素菌渣的近红外显微图像Fig.1 Near infrared microscopic images of soybean meal and three antibioticmycelial residues

图2 3种豆粕光谱及其平均光谱Fig.2 Spectra and average spectra of three kinds of soybean meal

由豆粕光谱与3种抗生素菌渣光谱的皮尔逊相关系数，豆粕与3种抗生素菌渣的相似性由大到小依次为硫酸链霉素(0.991)、硫酸粘杆菌素(0.972)、土霉素(0.960)。

图3a为3种抗生素菌渣与豆粕的光谱图像，为使不同样品的差异性更明显，图3b展示了样品的近红外二阶导数光谱，从二阶导数光谱中能够看出，在6 200～5 800 cm-1和5 500～5 000 cm-1区域存在显著差异，这些区间主要反映水(5 200～5 100 cm-1)、蛋白(4 870～4 400 cm-1)、多糖(4 400～4 300 cm-1)、脂肪(5 790～5 690 cm-1和4 340～4 260 cm-1)等含氢基团的近红外光谱特征，通过对豆粕和3种抗生素菌渣的近红外二阶导数光谱分析可知，两种物料之间存在差异，因此可以使用合适的判别模型对二者进行鉴别分析。

2.2 基于不同预处理方法和建模方法建立相应判别模型

表2 基于不同预处理方法的豆粕与抗生素菌渣PLS-DA判别模型结果Tab.2 Qualitative discriminant results of soybean meal and antibiotic mycelial residue in PLS-DA model withdifferent pretreatment methods

表3 基于不同预处理方法的豆粕与抗生素菌渣SVM-DA定性判别模型结果Tab.3 Qualitative discriminant results of soybean meal and antibiotic mycelial residue in SVM-DA model PLSwith different pretreatment methods

2.3 近红外显微成像定性判别模型的外部独立验证

为验证所建立的定性判别模型的准确性，本研究采用外部独立验证对所建立模型的准确性加以验证，验证集的结果如表2和表3所示。PLS-DA模型的判别正确率在99.4%以上，其中判别2、3、4的判别正确率达到100%。SVM-DA模型的正确率几乎为100%，仅有判别1中的二阶导数处理模型存在判别错误。从验证集的结果分析，也可验证SVM-DA模型的定性鉴别结果优于PLS-DA模型，判别2和判别3的判别效果优于判别1和判别4。

3 结束语

针对目前缺乏对饲料中抗生素菌渣快速检测手段的问题，在豆粕与抗生素菌渣具有相似成分组成的前提下，本文提出了采用近红外显微成像技术从样品微区光谱入手分析饲料样品，旨在以豆粕和3种抗生素菌渣(硫酸链霉素菌渣、土霉素菌渣、硫酸粘杆菌素菌渣)为例论证基于近红外显微成像技术快速检测饲料中抗生素菌渣的可行性。采用PLS-DA和SVM-DA的定性判别模型，对豆粕和抗生素菌渣的种类进行鉴别分析。研究表明，豆粕和3种抗生素菌渣的主要成分虽然相似，但是利用近红外显微成像技术结合定性判别模型的种类鉴别效果比较理想。PLS-DA和SVM-DA模型分析及其外部独立验证表明，基于近红外显微成像光谱数据可以有效对豆粕和抗生素菌渣进行鉴别分析，SVM-DA模型优于PLS-DA模型，定性判别正确率达到99.4%以上。通过该研究可知：近红外显微成像光谱能够定性区分豆粕和抗生素菌渣，为饲料中抗生素菌渣鉴别提供了思路，有进一步研究的价值。

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