白及种苗的最佳生长条件筛选

2018-01-17王跃华刘媛媛罗晴方

种子 2017年12期

王跃华，陈燕，周欢，刘曼，刘媛媛，罗晴方

（成都大学，四川成都610106）

白及（Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.）为兰科（Orchidaceae）白及属（BletillaRchb.f.）多年生草本植物，以干燥块茎入药。具有收敛止血、清热解毒、消肿生肌之功效［1］。常用于治疗咯血吐血，外伤出血，痈疽肿毒，溃疡疼痛，皮肤皲裂等症［2］。随着现代科技的不断发展，白及作为传统中草药和观赏植物被广泛应用，而且在化妆品的应用中也日益受到重视［3］。然而由于过度采挖，导致其野生自然资源急剧减少。且白及种子在自然条件下极难萌发［4］，传统分株繁殖的方式又因繁殖速度慢，繁殖率不高而难以满足市场需求。因此，若能利用组织培养技术大量生产种苗，将为资源的可持续利用奠定基础。有关白及的种子萌发与组织培养研究已有不少报道［5－8］，田翠英等研究表明，细胞分裂素BA能促进白及幼苗的增殖，GA与番茄汁有利于其生根壮苗［9］；宋智琴等研究表明，香蕉泥、马铃薯泥、番茄泥与胡萝卜泥4种有机添加物对白及组培苗生长的影响存在一定的差异，香蕉能显著促进白及组培苗的生长发育，起到壮苗和增大球茎的作用［10］。而通过添加有机荞麦添加物促进白及种苗生长的研究，目前未见相关文献报道。本研究利用正交试验对白及生长条件进行系统研究，在改变培养基成分的基础上优化培养条件，并且特别添加天然成分荞麦，以期获得白及快速生长的最佳条件，为白及快繁及大规模工厂化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

SW－CJ－2F型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；YH－JZ－H接种器械灭菌器（上海宇涵生物科技有限公司）；LDZX－75KB立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）。

1.1.2 种子

白及种子采集于四川省成都市都江堰市龙池镇。10月中下旬种子变为黄褐色时采集。采集后存于5℃冰箱中备用。

宁荞1号、丰甜1号和西荞2号荞麦种子由成都大学国家杂粮加工技术研发中心种子储藏室提供。

1.2 方法

1.2.1 白及种子的选取和消毒

选取成熟的白及种子，首先在超净工作台上将种子装入灭菌的离心管内并加入0.1%的升汞（种子∶升汞＝1∶5）消毒11min，不断摇晃离心管，使种子与升汞充分接触。然后将升汞与种子混合液倒入500mL烧杯中加无菌水稀释至500mL刻度线。最后用无菌胶头滴管从烧杯中吸取种子和无菌水的混合液均匀滴加至培养基表面。

1.2.2 荞麦添加物的制取

分别选用宁荞1号、丰甜1号和西荞2号3种荞麦种子，经48h的萌发生长后，选取胚根长度为1～2cm的荞麦萌发种子，去掉胚芽上的种皮，用粉碎机加水（荞麦胚芽∶水＝1∶1）粉碎制成荞麦添加物。

1.2.3 实验设计

采用4因素4水平的试验，正交表选用L16（44）表头设计。正交表中A，B，C，D对应4因素：基础培养基、光照时间、荞麦添加物、赤霉素浓度，各水平见表1。研究不同基础培养基、不同光照时间、不同种类的荞麦添加物和不同浓度的赤霉素对白及幼苗生长的影响。

表1 白及种苗快速生长因素水平表

1.2.4 培养条件和数据分析

白及种子在温度为（22±2）℃，光照强度为1 200～1 800lx的条件下培养50d后，统计白及苗的生长状况，并测量出白及幼苗的生长高度。

使用正交助手Ⅱ完成正交试验的设计和数据分析。

2 结果与分析

2.1 白及幼苗快速生长的正交试验结果

培养基的成分、添加物以及光照时间对植物的生长都有极其重要的作用。为了寻求白及幼苗的快速生长条件，本试验设计了16组试验，培养50d后，统计白及幼苗的生长状况并测量幼苗高度，结果见表2。

由表2可以看出，参试的16个组合中，15号组合A4B3C2D4表现较佳。通过观察15号白及种子萌发和种苗的生长情况可知，白及种子在接入培养基10d后种子开始吸水膨胀，12d后吸胀变为黄绿，15d后种子一端出现深色绿点，20d后种子圆球部分膨大，在解剖镜下可见种子有绿点端长出1片子叶，种皮完全爆开，25d后解剖镜下可观察到，伴随第1片子叶的增长，真叶开始萌发，经过50d培养后白及苗高达14.18mm。

由表2极差分析结果可知，影响白及种苗生长高度因素的高低顺序依次是：RC＞RB＞RA＞RD，即白及生长条件中影响幼苗生长的主要因素是添加物，其次是光照时间，再次是基础培养基，影响最小的是赤霉素。根据各因素各水平所对应指标结果的平均值可以确定组合A1B3C2D1为最佳培养方案，即白及幼苗生长的最佳培养条件是光照12h，最佳培养基是1／4MS＋20g／L宁荞1号。经过验证实验可知，最佳培养方案条件下培养50d的白及苗高可达16.58mm。

表2 白及种苗快速生长正交试验结果及极差分析

2.2 因素指标分析

图1 因素指标效应曲线

为了获得直观分析，根据试验结果，以因素为横坐标，白及苗高为纵坐标，作效应曲线（图1）。由图1可知，白及种苗生长的最佳方案为A1B3C2D1，即白及幼苗生长的最佳培养条件为光照12h，最佳培养基为1／4MS＋20g／L宁荞1号。各因素对白及苗高的影响次序为：添加物＞光照时间＞培养基＞赤霉素，在4个因素中荞麦添加物对白及苗高的影响最大。3种荞麦添加物中对白及苗高的影响次序为：宁荞1号＞丰甜1号＞西荞2号，宁荞1号对白及苗高影响最大，平均苗高可达无添加物实验组的2.49倍。

2.3 方差分析

进一步比较各因素对白及种苗生长的影响和探究4种因素之间的联系，以白及幼苗高度为测定指标，在极差分析的基础之上进行方差分析，结果见表3。

从表3可见，本试验设置的4个因素中，3个对试验结果有显著影响，其中2个对试验结果有极显著影响。因素 A 检验值 F＝14.29，F0.05＝9.28，F0.01＝29.5，F0.05＜F＜F0.01，因而因素 A 对促进白及种苗的生长有显著影响（0.01＜p＜0.05）；同理，因素B和因素C的检验值F均大于F0.01，因而因素B和因素C对试验结果都有极显著的影响（p＜0.01）；因素D的检验值F小于F0.05，因而因素D对试验结果无显著影响（p＞0.05）。比较4个因素的检验值可以得出FC＞FB＞FA＞FD，所以影响白及种苗生长高度的最主要因素是添加物，其次是光照时间，再次是基础培养，赤霉素影响最小，此结果与极差分析的结果一致。

表3 白及种苗快速生长方差分析

3 结论与讨论

应用组织培养技术快速生产白及种苗是解决白及资源紧缺的重要方式之一。天然的有机添加物含有丰富的营养物质，能为植物生长提供一些生理活性物质和补充微量成分，对其生长有显著的促进作用。又由于其价格低廉、材料易得、制作简便等优势而广泛应用于组培苗的规模化生产中。本研究结果表明，3种荞麦添加物中对白及苗高影响最大的是宁荞1号，其次是丰甜1号，最后是西荞2号。其中添加宁荞1号实验组的平均苗高可达无添加物实验组的2.49倍，可见在培养基中添加荞麦能有效促进白及种苗的快速生长。

熊双丽等在苦荞和甜荞麦粉及麦壳中总黄酮的提取和自由基清除活性的研究中发现，苦荞麦中总黄酮得率为2%～3%，甜荞麦中总黄酮得率为1%～2%［11］；王静霞等在荞麦和商品苦荞茶中总黄酮的含量测定中发现，苦荞的总黄酮含量在13.67～21.56mg／g之间，甜荞总黄酮含量在5.79～7.23mg／g之间［12］；唐宇等在荞麦中黄酮含量的研究中发现，在28个苦荞麦品种中，籽粒的黄酮含量平均值为2.02%，而20个甜荞品种籽粒的黄酮含量平均值为0.23%［13］。上述研究均表明，苦荞麦的黄酮含量远远高于甜荞麦。本研究结果表明，添加荞麦试验组的白及显著好于没有添加荞麦的试验组，黄酮含量低的甜荞麦（宁荞1号和丰甜1号）比黄酮含量高的苦荞麦（西荞2号）对白及种苗生长的促进作用更强。因而笔者推测荞麦添加物中对白及生长起促进作用的物质并不是荞麦中的黄酮类化合物。

张美莉在萌发荞麦种子内黄酮与蛋白质的动态变化及抗氧化性研究中发现，荞麦萌发后可溶糖含量呈上升趋势，不同品种荞麦可溶糖含量变化趋势一致，但甜荞可溶糖含量高于苦荞［14］。马元喜在不同土壤对小麦系生长动态的研究中发现，健壮的根孕穗期可溶糖含量为6%～8%，虚弱的根则为2.5%～3.5%，即可溶糖对植物的生长具有促进作用［15］。本研究中，可溶糖含量高的实验组（宁荞1号和丰甜1号）对白及种苗生长的促进作用明显高于可溶糖含量低的实验组（西荞2号）。因而，笔者推测荞麦添加物中的可溶糖促进了白及种苗的生长。

［1］扬春澍.药用植物学［M］.上海：上海科学技术出版社，1998：326－327.

［2］孙乐乐，杨永红，刘军凯，等.白及的本草考证［J］.中药材，2010，33（12）：1 965－1 968.

［3］刘光斌，黄忠，黄长干，等.天然植物白芨胶的功能及在化妆品中的应用［J］.日用化学品科学，2005，28（8）：22－24.

［4］崔瑞勤，陈科力，徐雷.珍稀药用植物白及种苗人工繁育技术研究进展［J］.现代中药研究与实践，2016，30（3）：79－83.

［5］杨平飞，张金霞，罗鸣，等.不同处理对白及种子无菌萌发及培养与驯化的影响［J］.时珍国医国药，2016，27（8）：1 988－1 990.

［6］张燕，黎斌，李思锋.不同培养基上白芨的种子萌发与幼苗形态发生［J］.西北植物学报，2009，29（8）：1 584－1 589.

［7］陈灿，陈海霞.白芨繁殖研究进展［J］.湖南农业科学，2015（5）：135－137.

［8］叶佳丽，李伟平，熊明星，等.不同激素对白及愈伤组织总酚含量的影响［J］.中药材，2014，37（2）：192－194.

［9］田翠英，袁雄强.白芨组织培养快繁技术研究［J］.江苏农业科学，2006（4）：75－77.

［10］宋智琴，杨平飞，罗鸣，等.不同添加物对白及组培壮苗培养的影响［J］.贵州农业科学，2016，44（3）：138－140.

［11］熊双丽，李安林，任飞，等.苦荞和甜荞麦粉及麦壳中总黄酮的提取和自由基清除活性［J］.食品科学，2009，30（3）：118－122.

［12］王静霞，黄艳菲，赵小燕，等.荞麦和商品苦荞茶中总黄酮的含量测定［J］.食品工业科技，2013（2）：58－60.