榛蘑多糖提取液脱蛋白方法的研究

侯 越，包鸿慧

（黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319）

0 引言

多糖也称多聚糖，是10个以上单糖残基用糖苷键相连而成的聚合体，是构成生命的四大基本物质之一[1]。在自然界中90%以上的碳水化合物都是以多糖形式存在的，它直接参与生物体的基本代谢过程，对生物体的代谢过程产生积极影响。中外医药学家现已证实，多糖及多糖类产品对慢性疾病有着显著的食疗效果。随着生活水平的提高和人口老龄化时代的到来，人们将更加关注保健与养生，而多糖类的广泛性与显著的生物学活性，正好契合这种需要。而且，研究发现多糖对人体无毒副作用，被誉为“21世纪”人类医学保健领域的救星。因其特殊的生理作用，多糖现已成为国内外众多学科领域研究的热点之一。但截至目前，人们对多糖的研究还远远不如蛋白质和核酸那样深入。

榛蘑，学名蜜环菌，为白蘑科植物蜜环菌的子实体，是我国一种十分重要的药食兼用真菌。榛蘑营养丰富，含有人体必需的多种氨基酸和维生素。现代药理学研究表明，榛蘑多糖具有抗辐射、促进造血、抑制肿瘤生长和调节免疫等药理作用[2]，相关研究表明，在多糖的提取过程中，提取液中的部分多糖会与一些游离蛋白质共存，并形成糖蛋白复合物，使得蛋白质难以脱除。而脱除蛋白是多糖纯化的一个重要步骤，纯化程度对研究多糖的生物功能性尤为重要，如何在尽可能多地保留多糖的有效成分的前提下将蛋白质除去，是多糖纯化试验的关键部分。

1 脱蛋白的方法

应用蛋白质沉淀、多糖不沉淀的原理，可将多糖提取液中的蛋白质脱去。主要采用Sevage法、三氯乙酸法、三氟三氯乙烷法等方法[3]，在多糖的纯化除杂中，将结合成糖蛋白形式的结构复杂、组成多样的蛋白质和多糖分离开来。

1.1 Sevage法

根据氯仿等有机溶剂会导致蛋白质变性的特点，将多糖提取液与Sevage试剂[氯仿∶正丁醇=5∶1（V/V）]按照 5∶1的比例混匀后，剧烈振摇 20～30 min，蛋白质结构遭到破坏，变性形成凝胶，变性的蛋白质存在于水层和有机溶剂层分层交界处，经离心可除去[4]。张立娟等人[5]通过研究Sevage试剂配比（氯仿∶正丁醇）、多糖提取液与Sevage试剂的体积比对多糖含量及蛋白脱除率的影响，通过试验得出Sevage试剂配比（氯仿∶正丁醇） 5∶1，多糖提取液与Sevage试剂的体积比4∶1为最优配比，由此提取条件得出的多糖含量42.39%，蛋白质的脱除率82.07%。

此方法条件温和，虽不会引起多糖的变性，但只局限于将多糖提取液中游离的蛋白质去除，不适于脱除与多糖紧密结合的蛋白质，且需重复多次，效率也低，同时由于试验次数过多，也会造成少量的多糖流失。在试验操作过程中可以配合加入一些蛋白质水解酶，使脱除蛋白的效果更佳。

1.2 三氯乙酸法

三氯乙酸除蛋白的原理是利用蛋白质会在有机酸的作用下发生变性，形成不可逆的沉淀这一特性除去提取液中的蛋白质，通常是于低温条件下将5%等体积的三氯乙酸溶液滴加至多糖提取液中，充分混匀后，于4℃条件下静置过夜，将胶状沉淀通过离心后除去。反复多次试验至不再浑浊，最终得到除去蛋白的多糖溶液[6]。三氯乙酸体积分数越大，除蛋白质效果越好，但对多糖的影响也越大，可能是三氯乙酸对多糖结构具有破坏作用，使多糖降解，结构受到影响，经该法脱蛋白的多糖复溶性变差，而且这种破坏作用随着三氯乙酸体积分数增大而增强[7]。赵师师等人[8]在三氯乙酸法脱除石榴皮多糖蛋白质试验中采用三氯乙酸体积分数5%，振摇时间10 min，脱蛋白次数3次，在此条件下石榴皮多糖中蛋白率脱除率达89.0%，多糖损失率为8.4%。陈湘[9]在黄蘑除蛋白试验中直接向多糖溶液中加入三氯乙酸晶体，通过不同TCA用量考查其吸光度和多糖质量分数后发现，粗多糖与三氯乙酸质量比为1∶6时除蛋白效果较好。

1.3 三氟三氯乙烷法

三氟三氯乙烷法是将等体积的三氟三氯乙烷加入到多糖提取液中，混合均匀后于低温下搅拌10 min，水层经离心后分离，重复处理2次，即可得到除去蛋白质的多糖溶液[10]。杨景明等人[11]将制备的防风粗多糖用水溶解，将等体积的三氟三氯乙烷加入到多糖溶液中，低温搅拌10 min，离心后分取水层，再用上述溶剂处理2次，得到无蛋白质的防风多糖溶液。三氟三氯乙烷法的优点是蛋白去除率较高，但由于三氟三氯乙烷沸点较低、易挥发，不宜大量应用，同时搅拌时应注意在低温下进行。

1.4 盐酸法

盐酸法就是利用蛋白质在等电点时溶解度最低的这一特性，使多糖中的蛋白在酸性溶液中沉淀，此方法是为了降低多糖在酸性条件下的分解[12]。张海燕[13]在山药多糖除蛋白的相关试验中通过测定其蛋白质含量和多糖含量，综合蛋白质脱除率和多糖保留率，确定盐酸法除蛋白的最佳条件为pH值2.0，此时脱蛋白率为93.95%，多糖保留率为67.74%。盐酸脱蛋白法的优点是高效，但因其需要严格的试验条件，如条件不足则会使得多糖被水解，从造成损失。

1.5 酒精变性法

酒精变性法的原理是利用蛋白质经有机溶剂变性处理后难与水互溶，而多糖沉淀后可复溶于水这一特点将蛋白去除。董宏平等人[14]在对水花微囊藻多糖除蛋白试验中采用酒精变性法除蛋白。试验结果表明，酒精可以有效去除蛋白，多糖提取液的蛋白去除量可达64.8%～75.8%。该法的优点是操作简便、试剂无毒无污染。但会降低多糖的回收率，原因是部分多糖会与蛋白结合，导致复溶性变差，难以回收。同时，在大量提取时会消耗大量的乙醇，成本较高，不宜采用此方法。

2 结语

每一种脱蛋白的方法，除蛋白效率都较高，但却有各自的缺点。Sevage法作为最常用的除蛋白方法，会消耗较多有机溶剂，容易造成多糖的损失，应用时应着重考虑去蛋白的次数来减少损耗。三氯乙酸法脱蛋白后多糖的复溶性明显减弱。三氟三氯乙烷沸点较低、易挥发，不宜大量应用。盐酸法脱蛋白率虽然高，但多糖的损失率也较高。酒精变性法虽可获得较高的蛋白去除率且操作简便，但会降低多糖的回收率，原因是部分多糖会与蛋白结合，导致复溶性变差，难以回收。除以上几种常用方法外，近年来人们还在不断探索其他有效的脱蛋白法，如氢氧化钠法、氯化钙法、反复冻融法、阴离子交换树脂法、径向流动色谱法、蛋白酶法等[15]。在进行榛蘑脱蛋白纯化试验中可以选择不同的方法进行联用，以此达到最佳的脱蛋白效果。