稀土上转换材料活体干细胞示踪技术的研究进展

张慧中 综述 刘凯 审校

在目前的再生医学研究中，干细胞移植治疗始终是重中之重[1]。为了检验治疗与疗效的相关性，所移植干细胞在宿主体内的位置、活性、数量、停留时间、分化情况及转归等，都是至关重要的评判依据[2]。然而，常用的量化检验手段多基于取样后的体外组织学检测，在丧失实时性、可靠性之余，也无法避免处死实验动物或者二次组织创伤。为了解决上述问题，Weissleder等[3]提出了分子影像学（Molecular Imaging）的概念。此后，建立无创而精确的活体内细胞示踪方法，逐渐发展成为干细胞研究领域的一大热点。分子影像学可理解为以量化示踪体内特定的细胞或分子为目的的动物活体成像方法，包含两大要素，即高亲和力的探针和可放大信号的图像采集系统[4]。其中，探针包含报告基因、外源性标记物或显影剂等，成像系统则包含共聚焦荧光显微镜、动物活体成像仪、MRI、CT、超声等[5]，两大元素不同的组合各有优势与不足。为了能最大化探针的高灵敏度和影像学的高时空分辨度，联合多种成像优势的多模态示踪技术备受关注。在基于光学成像探针的选择上，外源性纳米标记物凭借标记方法简便、无生物自荧光、高信噪比、低光漂白性、低细胞光损害等优势而广受青睐[6]，尤其是上转换纳米材料（Upconcersion Nanoparticle，UCNP）[7]和半导体量子点（Quantum Dot，QD）[8]，而 UCNP 因为成分多为稀土，其细胞毒性远远小于含有重金属的QD[9]，故更具优势。UCNP不仅具备光学探针所需的优良属性，还是极为理想的影像学造影剂。UCNP的多功能性已在分子靶向结合探测、细胞或器官示踪发光成像、影像学造影、肿瘤光敏治疗等领域得到了广泛的研究开发，并有望建立分子影像学临床应用的纳米材料平台[10]，其在干细胞治疗的机理探究中也将发挥无可估量的推动作用。

1 稀土上转换材料的研发和制备

1.1 上转换发光的概念及发展

上转换发光（Upconversion Luminescence，UCL）的定义是：连续吸收两个或多个低能量、波长较长的入射光子并将其转变成一个高能量、波长较短的发射光子的非线性光学过程[7]。其中所吸收的激发光通常为波长980 nm（组织穿透力极高）的近红外光（Near Infrared，NIR）[11]。而常用的如绿色荧光蛋白（GFP）、荧光素酶（luciferase）等有机荧光探针的发光原理与之正相反，为高能量光（通常为穿透力较差、对细胞损害较大的紫外光[12]）激发出低能量可见光，称为下转换发光（Downconversion Luminescence，DCL）[13]， 又称为斯托克发光（Stokes Emission）[14]，因而 UCL又被称作反斯托克发光（Anti-Stokes Emission）[15]。 UCL 的概念最早由 Auzel等[16]基于 Bloembergen[17]的假说所提出并研发，经改良拓展逐步投入到生物、药物检测等分子影像学的应用中。

1.2 UCNP的制备

目前，为了制备上转换材料，稀土元素仍是必不可少的，尤其是镧系元素 （Ln series）离子，包括钇Y3+、镱Yb3+、钆Gd3+、铒 Er3+、钬 Ho3+、铥 Tm3+等，其相对含量对于材料的上转换性能、生物安全性等均有决定性影响[18]。常用的稀土上转换材料是通过在固体晶格（多为氟化物）中掺杂稀土离子得到的。其中上转换理化特性俱佳的NaYF4是目前应用最广且最为理想的固体晶格[7]，离子半径相对最小的Yb3常被用作敏化剂，上转换特性最为突出的Er3+、Ho3+、Tm3+则常被作为激活剂[18]，通常 书 写为 NaYF4:Yb3+/Er3+或 NaYF4:Yb3+/Tm3+等[19-20]。在980 nm激发光下，UCNP可发出可见光及波长为800 nm左右的不可见光，其中掺有Er3+的材料所发可见光为绿色，掺有Tm3+的材料则为蓝紫色，掺有Ho3+的材料则为红色。而根据元素的比例等因素，所发光的波长可有大幅区别，从而使荧光成像的收集波长区域的设置更为灵活，因800 nm波长光组织穿透性更佳，故可将其设为收集波长范围，以提高荧光探测的灵敏度。鉴于稀土上转换材料粒径极小（10～500 nm不等[21]），故统称作上转换纳米材料（Upconcersion Nanoparticle/Nanophosphor，UCNP）。在不同时间段及不同条件的制备下，UCNP的形态各有不同，近期研究最常见的为六方相（Hexagonal-phase）的UCNP，其上转换效率最受认可，但亦有研究提出立方相的UCNP具有更强的组织穿透力[22]。为了增加UCNP的亲水性和生物相容性，需加一定的表面修饰，常用的包括二氧化硅、半胱氨酸、聚合物（PAA、PEG、PEI）、右旋糖酐、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）等进行外壳包裹[23]。综上可见，表面修饰的NaYF4:敏化剂/激活剂的六方相UCNP是目前较为经典的材料制备模式，但并不受局限，根据研究需要可使用不同的材料组合赋予相应的功能。目前常用的合成UCNP的方法包括水热法、热分解法、液相共沉淀法、微乳液法、溶胶-凝胶法等，对于成品的形状、粒径、发光颜色及强度等皆可灵活调控[24]。

2 UCNP示踪干细胞的应用

2.1 UCNP标记干细胞的方法共识

常用的有机荧光探针如GFP、RFP、EGFP等标记细胞的方式主要为病毒转染，纳米材料如量子点（QD）需要通过脂质体转染、电穿孔或穿膜肽等方法[25]，操作及耗材成本均较高。而UCNP标记细胞主要通过胞吞作用（Endocytosis）[26]，仅需将UCNP的颗粒混悬液与细胞共培养，材料即可随囊泡包裹进入细胞质。因UCNP是作为细胞内异物存在，故被胞吐后影响细胞示踪作用是一大问题。Zhao等[27]用transwell实验证明了14 d内摄取了UCNP的大鼠BMSC无明显的胞吐现象，Ma等[19]所研究的UCNP可在兔BMSC内停留至少21 d，并提出UCNP从囊泡内溢出进入细胞质内后停留时间可相对更久，可见UCNP有极大的长期标记干细胞的潜力。虽然标记方法简便，但是共培养时的细胞密度、UCNP相对细胞的浓度、共培养时间和条件、细胞应呈贴壁或悬浮状态等问题都会对UCNP的摄取效率有所影响，因此所采取的方案也各有不同。Abdul等[28]通过将成分为硅壳修饰的NaYF4:Yb3+/Er3+以100 μg/mL的混悬液浓度分别与贴壁的Wistar大鼠的BMSC及成肌细胞（肌肉前体细胞）共培养24 h。Idris等[29]为了提高UCNP摄取效率、节省初始共培养用量，在细胞悬浮状态下，将硅壳修饰的 NaYF4:Yb/Er（0～100 μg/mL）与鼠成肌细胞共培养40 min，UCNP摄取效率相对更高。此文献为仅有的关于UCNP与细胞混悬液共培养的报道，而细胞悬浮状态的摄取效率与贴壁状态之间的差异尚无结论。UCNP与干细胞共培养的最适时间也缺乏共识，在0.5～24 h间均有文献报道[19]，最适标记浓度在50～100 μg/mL左右[27-33]。而对于细胞适应能力较强的肿瘤细胞的标记，浓度与时间相对灵活。Chatterjee等[34]将PEI修饰的NaYF4:Yb3+/Er3+以5 mg/mL的混悬液浓度与肿瘤细胞共培养24 h，并证明对细胞活性无明显影响。目前尚无关于UCN的标记饱和浓度的研究报道。共培养的环境条件基本均为37℃、5%CO2，标记的细胞基本为70%～80%融合。为了去除未被摄取的UCNP，基本都采用PBS反复冲洗。为了在操作上尽量减少UCNP的团聚现象，超声振荡分散最为常用，也有选用0.22 μm膜过滤去除结块的材料[19]。

2.2 UCNP的生物安全性检测

作为潜在的临床转化的生物应用材料，UCNP的生物安全性需要足够严格完整的检验，目前已有大量研究多方面认可了其突出的低细胞毒性、高生物相容性等优势，而在活体内代谢的规律也有极重要的评估意义。

2.2.1 细胞毒性检测

目前，针对UCNP对干细胞的细胞毒性检测，其观察的材料共培养时间通常为12～48 h，久于所采用的UCNP工作标记时间，所研究的材料浓度梯度范围基本在0～200 μg/mL。Ma等[19]测得 PAH-PAA 修饰的 NaYF4:Yb/Er以 100～200 μg/mL标记24 h后，兔BMSC活性分别为56%和44%；Li等[30]测得RGD-硅壳修饰的NaYF4:Yb/Tm以100 μg/mL标记48 h后，hBMSC活性仍大于80%，而在30 min持续近红外光（NIR）照射下，细胞活性与对照组无明显差异。上述结果的差异较大，可能与结合的修饰分子和细胞来源有一定关系。Abdul等[28]将UCNP分别标记BMSC和成肌细胞，证实对环境更敏感的BMSC的活性受UCNP影响相对更大。Xu等[31]验证了200 μg/mL的PEG-PEI修饰的NaYGdF4:Yb/Er对人羊水干细胞（Amniotic Fluid Stem Cell，AFSC）的增殖没有明显影响。以上研究均在干细胞与UCNP共培养后即刻行CCK8或者MTT实验，而Zhao等[27]选择先共培养再换为新鲜培养液24 h后再进行细胞活性测试，所用UCNP为PEI修饰的NaYbF4:Tm/CaF2，测得100 μg/mL孵育24 h后的干细胞活性小于60%。相比之下，UCNP对肿瘤细胞的活性影响明显更低。Sun等[35]的研究显示，柠檬酸修饰的NaLuF4:Yb,Tm以1 mg/mL标记48 h后，人口腔表皮样癌细胞（KB cells）的活性仍大于90%。Ma等[36]用 800 μg/mL的 LaF3:Yb,Tm标记人胃癌细胞 （MGC-803 cells）12 h后，细胞活性仍大于60%。可见不同成分的UCNP针对不同肿瘤细胞的细胞毒性差异较大。以上细胞活性均随UCNP浓度增加而下降，但Wei等[37]发现半胱氨酸修饰的UCNP的标记浓度越高，所标记的HeLa细胞活性越高，可能是因为半胱氨酸的高亲和力促进了细胞的增殖。

2.2.2 对干细胞多向分化能力的影响

Hsieh等[38]发现量子点（QD）会削弱hBMSC成软骨的性能，可能是由于QD以被囊泡包裹的形式聚集在细胞核周围而影响了细胞器的功能。但UCNP对于干细胞分化性能的影响则极小，从而也体现出了相比于QD的优势。在成软骨方面，Hu等[32]验证了以氟磷灰石为晶格基质的UCNP在50 μg/mL的标记浓度下对BMSC成软骨体内、外诱导均无明显影响。而成骨方面，Ma等[19]证实了标记浓度大于100 μg/mL的UCNP对兔BMSC的成骨能力有显著影响，但50 μg/mL的UCNP则无明显影响。Zhao等[27]等证明BMSC与100 μg/mL浓度的UCNP共培养4 h后仍可正常成骨和成脂分化。Liang等[33]证明了 PEG、PEI修饰的 UCNP在标记浓度为 200 μg/ml时对人羊水干细胞的成骨分化能力没有显著影响。

2.2.3 生物分布检测

对于UCNP在活体内的定位定量检测，目前有报道的实验动物均为裸鼠，常用方法为980 nm激发活体荧光成像确定UCNP在各个脏器内的分布，并对各个主要脏器进行利用电感耦合等离子体原子发射光谱法 （ICP-AES）检测精确含量。Nyk等[39]通过将成分为NaYF4:Yb3+/Tm3+的UCNP尾静脉注射入Balb C小鼠体内，2 h后通过Maestro成像系统完成了首次活体上转换成像，可见到UCNP在脏器内的分布，但清晰度有限。Abdul等[28]以10 mg/Kg的浓度（组织中ICP可检测到的最低浓度）将UCNP混悬液由尾静脉注射入Wistar大鼠体内，分别于不同时间点取材并利用ICP-AES检测各个脏器内的UCNP含量。经观察，注射后大鼠的健康状态正常，ICP示30 min内UCNP大量集中于肺部，肝脏其次，24 h后各脏器中均急剧减少，7 d后基本通过尿路排尽，显示良好的生物安全性。Chatterjee等[34]将浓度为10 μg/mL的UCNP尾静脉注射入Wistar大鼠，得到同样结果。Wei等[37]通过活体生物成像仪检测裸鼠全身以及取出的各个脏器，同样观察到肺和肝脏的荧光信号最强。UCNP最先积聚于肺部的现象与干细胞治疗中在肺部大量集中的现象类似[31，40]。因此，将UCNP标记的干细胞停留在指定位置的效率将是今后研究中需要重视的关键问题。

3 UCNP上转换成像示踪移植干细胞的研究

3.1 体外标记干细胞成像

为了验证UCNP标记细胞的作用，Abdul等[28]通过将UCNP以0～100 μg/mL的混悬液浓度分别与Wistar大鼠的BMSC及肌成纤维细胞共培养24 h，然后彻底洗去未被摄入的UCNP，在980 nm激发光的共聚焦荧光显微镜下观察，可见发出绿色荧光的UCNP均匀分布于细胞质及细胞核周围，基本构成了细胞质的形态。Idris等[29]通过5 h的延时共聚焦荧光显微镜拍摄记录了UCNP标记的成肌细胞在体外低血清含量环境下的迁移，观察到2.5 h时可见细胞互相靠近，5 h时可见细胞自行排列成直线形轨迹。为了提高上转换成像质量，Yu等[41]研制了一套激光扫描上转换发光成像显微镜 （Laser scanning up-conversion luminescence microscopy，LSUCLM）。Xiong等[42]首次使用LSUCLM对UCNP标记的肿瘤细胞进行清晰显影。

3.2 体内上转换成像示踪干细胞

为了验证UCNP在活体内可探测到的深度，Chatterjee等[34]将100 μL的4.4 mg/mL的UCNP皮下注射入裸鼠腹股沟、背部、腹部（深度约10 mm），用980 nm激光器照射，CCD收集成像。剥去皮肤暴露肌肉的实验组UCNP荧光肉眼清晰可见，强度明显大于有皮肤未暴露肌肉的对照组，而100 μL的QD仅可在皮肤较透明的足部皮下见到其绿色荧光。Idris等[29]通过25 μg/mL浓度的UCNP标记观察到成肌细胞注射移植入肌肉创面后3 d内所移植细胞从注射点向远处扩散，但荧光信号于第7天显著减少，其原因可能为：①UCNP随细胞增殖和胞吐而被稀释；②宿主免疫系统导致细胞凋亡。此外，该研究还通过共聚焦显微镜观察UCNP标记的成肌细胞尾静脉注射后在大鼠耳部血管的分布，实现了无生物自荧光、高信噪比的单个细胞的活体示踪。Liang等[33]验证了PEG修饰的UCNP在Balb C小鼠背部皮下注射后，通过改良的Maestro活体成像系统显示的荧光信号强度和所注射的细胞量成正比，且可精确到捕捉10个干细胞的信号，而QD、超顺磁性氧化铁颗粒（USPIO）能检测到的细胞量至少上千个[43]。之后他们还成功地利用UCNP活体示踪了尾静脉移植入急性肺损伤模型的羊水干细胞。

4 UCNP结合特定分子的功能对干细胞靶向示踪应用的启示

除了荧光成像所严格要求的高信噪比、光稳定性、生物安全性等绝对优势，UCNP尚有一极为关键的功能，即可结合任何类型的功能团。最为常用的方法为通过配体交换法[37]、配体氧化法[44]、SiO2包裹法[28]等使原本表面为疏水的巯水基的UCNP表面最终带有亲水的氨基、羧基或巯基，从而获得了与各类生物分子共价偶联的能力，并可广泛运用于靶向相关的生物应用中。针对干细胞，Li等[30]将促软骨化药物Kartogenin（KGN）通过光敏笼状连接物（Photocaged linker）结合于 RGD、硅壳修饰的UCNP，使之被hBMSC摄入，并实现了光敏调控干细胞的分化。光敏的主要原理为：经近红外光NIR刺激，UCNP释放紫外光，使光敏连接物产生光裂解，其中的KGN得到释放并作用于干细胞。此外，UCNP在干细胞的靶向运用方面鲜有报道，但在免疫和肿瘤检测方面的应用是其向干细胞方向推广的重要参考。

4.1 结合抗体用于免疫检测及靶向治疗

2000年，UCNP就已经广泛应用于免疫层析检测[45]，主要用于食品药品检测方面[46-47]，医学生物方面可检测人乳头瘤病毒、hCG、雌二醇等[48]。在免疫细胞组织化学方面，Zijlmans等[49]用结合了亲和素和CD44的UCNP成功识别了鼠前列腺特异性抗原及人淋巴细胞。2001年，他们成功开发了UCNP作为DNA芯片的功能，并提出非特异性结合可用封闭剂避免[48]。Nagarajan等[50]验证了结合了间隙黏连蛋白抗体的UCNP可特异性标记，与BMSC共培养心脏细胞H9c2。Xiang等[51]通过结合了特异性抗原的UCNP靶向识别C57BL/6鼠体内的树突状细胞，并实现更高效的疫苗注射。

4.2 肿瘤靶向探针的应用

Chatterjee等[34]将叶酸共价结合于UCNP，与腺癌细胞HT29、卵巢癌细胞OVCAR3（均过表达叶酸受体）共培养24 h，显示其被细胞摄入明显多于未结合叶酸的UCNP，证明了此法可特异性标记肿瘤细胞。Xiong等[52]使用结合叶酸的UCNP尾静脉注射入分别移植了HeLa细胞和MCF-7细胞的裸鼠体内，注射后24 h可见在Hela肿瘤中有大量UCNP荧光信号，而MCF-7肿瘤中则极少，从而验证了结合叶酸的UCNP可作为过表达叶酸受体的HeLa肿瘤的特异性活体靶向探针。他们还用同样的方法验证了UCNP可作为过表达αvβ3整合素受体的人乳腺癌细胞MCF-7的特异性靶向探针[42]。

肿瘤中过表达的分子常有极高的特异性，因而UCNP的研究大量集中于肿瘤靶向诊治。但在不同的组织缺损或病理区域中也会有特异性表达的生物标记，若可以提升靶向定位的特异性分子的灵敏度，结合UCNP的携带作用及良好的生物相容性，即可为提高干细胞归巢效率等提供新方法。

5 上转换成像结合影像学检测的多模态示踪系统的应用

UCNP虽有独特的上转换成像性能，但其灵敏度和空间分辨率远不及CT，而CT则缺乏MRI的解剖探测深度。可喜的是，UCNP同样具备理想的影像学造影属性，可与UCL、MRI、CT结合后成为多模态成像示踪系统。

5.1 UCNP的MRI造影应用

由于MRI的纵向弛豫T1造影剂Gd-DTPA中的Gd是稀土元素中的一种，具有强磁性，故掺入Gd的UCNP具有T1的MRI造影能力，以Gd2O3为固体晶格的UCNP的显影信号甚至强于Gd-DTPA[53]。Liu等[54]验证了结合抗-EGFR抗体的NaGdF4:Yb/Er可靶向识别裸鼠体内的肿瘤并在MRI中显影。在横向驰豫T2方面，临床常用的造影剂Feridex成分为超顺磁性氧化铁颗粒 （USPIO），故结合USPIO即可赋予UCNP横向驰豫T2的MRI造影能力。Zhou等[55]将结合氧化铁的UCNP注射入裸鼠的前掌，通过T2信号增强的MRI以及上转换成像UCL对其淋巴结进行清晰显影。除了结合SPIO，掺入具铁磁性的钴Co2+亦可赋予T2的MRI造影能力。Xia等[56]用掺入Co2+的NaYF4:Yb/Tm作为造影剂经静脉注射实现了裸鼠的活体T2显影。综上所述，利用MRI对于深层解剖结构的精确显影，结合UCNP光学成像的基本定位，从而对于干细胞在较深组织中的位置可进行更准确的定位定量。因此，结合多种成像方式的多模态成像系统目前备受重视[5]。

5.2 UCNP的CT造影应用

稀土元素本身即具备一定的CT显影强度，其中Gd同样较为常用。He等[57]证实了NaGdF4:Yb/Er在裸鼠皮下可经CT显影。然而，为了使显影强度增加，即X射线衰减系数增强（X-ray attenuation coefficient），需要增加固体晶格内稀土元素的含量比例，并选择原子数更高的稀土元素合成固体晶格。Ma等[36]选择了LaF3作为晶格，其中镧La3+的含量比例较常用晶格更高，合成的UCNP在肌肉内经CT可清晰区别于周围软组织显影。Sun等[35]则选用NaLuF4作为晶格，其中镥Lu3+是原子量最大的稀土镧系元素，所制得的UCNP的X射线衰减系数明显高于常用造影剂碘普罗胺（Iopromide），从裸鼠足部注射，经CT三维重建得到了与上转换成像一致的腿部淋巴管的形态分布。Xing等[58]选用了BaYbF5作为晶格，验证了BaYbF5:Er的X射线衰减系数显著强于常用造影剂碘比醇（Iobitridol）。结合相关的核素，UCNP可成为SPECT/CT的理想造影剂。Kostiv等[59]将125I标记的NaYF4:Yb/Er经尾静脉注射，通过SPECT/CT成像可观察到30 min内即在肝脏聚集显影。

6 关于UCNP在干细胞示踪方面应用的展望

从材料研发角度来看，所采用的元素在保证UCNP的上转换发光性能以及影像学造影性能的同时，还需注意其粒径大小和生物安全性。此外，由于UCNP在液体中的分散性对于其转染细胞效率有着关键作用，故其表面的生物相容性修饰也不可或缺。在标记细胞方面，目前已有的研究对于所采用的标记浓度、方法、时间、条件基本趋于一致，相比于耐受性极强的肿瘤细胞，干细胞的标记浓度和时间均受到一定的局限，从而对于实现更高强度的上转换荧光成像和影像学显影形成一定的挑战。在实验动物的选择方面，由于上转换荧光活体成像仪器大小和普及度的局限，实验动物局限于体型较小的裸鼠或大鼠，而荧光的穿透深度常受毛发及皮肤厚度的限制，目前已实现可穿透黑色毛发达到2 cm深度的上转换荧光[22]。UCNP在肿瘤相关的靶向应用已日趋成熟，而干细胞相关的研究则相对欠缺，缺乏标记细胞的各种标准。目前，干细胞治疗的确切机制以及靶向归巢作用，是限制该领域发展的两大障碍。UCNP的多模态分子影像学的潜能有可能极大地推动该领域的进展。期待能更多地开展UCNP示踪并靶向引导不同干细胞治疗的研究，实现更高效的基础标准，并明确机制和最终的临床转化。