分离沙门氏菌的注意事项

曾金金，赵玮

(1.潍坊出入境检验检疫局技术中心，山东 潍坊 261041；2.山东益生畜禽疾病研究院，山东 烟台 265508)

沙门氏菌是一种严重危害人和动物的致病菌，对种鸡危害巨大。其能定居于机体内多个内脏器官，通过生殖系统和粪便能够垂直传播和水平传播。产蛋种鸡感染沙门氏菌后引起死淘增加，饲料转换率降低，生产性能下降，种蛋孵化水平下降；雏鸡感染沙门氏菌后，死淘增加，严重影响产品质量。因此，在实验室进行沙门氏菌的分离鉴定工作对生产现场具有非常重要的指导意义。本文就沙门氏菌的分离鉴定时的注意事项进行总结如下。

1 样品采集

1.1 病死鸡的病料采集 病死鸡一般取其肝脏、脾脏、卵巢、肠道；新生雏鸡取其肝脏、卵黄，样品采集要求无菌操作。

1.2 环境采样

1.2.1 水样的采集 采集点为养殖场的水源、鸡舍水线（包括前端、后端），先将出水点周围消毒，再用灭菌瓶接取水样以免环境中的细菌进入样品中影响结果。

1.2.2 饲料的采集 不同点采集饲料，采样总量为100g混匀，随机采样2份。

1.2.3 垫料或粪便、灰尘采样 对于平养场区，在鸡舍内不同区域采取垫料、鸡粪，在鸡舍的前中后至少均匀取5个点，每个点取样至少10g，混匀，不同鸡舍或不同栏总采集5份，或者采样时采样者穿着一次性鞋套在鸡舍内走三圈，然后把鞋套底朝内翻转装入封口袋待检，不同鸡舍或栏采集样本5份。笼养场鸡舍内用同一棉签蘸取多点，要求10点以上，采集样本10份装入封口袋待检。

2 样品的保存及运输

样品采集后若不能及时检测，要放入4℃保存，样品在运输过程中要保证温度。夏天避免温度过高导致腐败，冬天避免结冰。

3 增菌液的选择

培养沙门氏菌的前增菌液有蛋白胨缓冲水、胰酶解酪蛋白大豆肉汤培养基，选择性肉汤培养基有亚硒酸盐胱氨酸肉汤（SC）、氯化镁孔雀绿、液体连四硫酸盐等。由于前增菌液对沙门氏菌的选择性不高，所以实际分离过程中可以将沙门氏菌选择性肉汤作为增菌液进行增菌，不同来源的样品所携带的细菌种类不同，因此分离沙门氏菌时就要选择不同的增菌液。由于硒对人体有毒性作用，所以SC现在使用较少。

3.1 病死鸡病料的沙门氏菌分离。由于病死鸡病料中所携带细菌种类较少，对增菌液的选择性不高，SC、氯化镁孔雀绿、四硫磺酸钠煌绿（TTB）、液体连四硫酸盐都可以对其进行增菌，也可以取其肝脏、脾脏、卵巢直接划线接种于鉴别培养基进行分离培养。

3.2 肛拭子、粪便（包括雏鸡胎粪）、肠内容物、垫料、灰尘进行沙门氏菌分离时一般选择液体连四硫酸盐增菌液进行增菌，效果较好。

3.3 水、饲料、种蛋可以选择SC、氯化镁孔雀绿、液体连四硫酸盐进行增菌。

4 鉴别培养基的选择

样品增菌24h后，要划线接种于鉴别培养基，沙门氏菌的鉴别培养基有SS琼脂、木糖赖氨萜醇-4培养基（XLT4）、胆硫乳琼脂培养基（DHL）、麦康凯、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（XLD）、亮绿（BG）、沙门氏菌显色培养基等等，沙门氏菌在不同培养基上生长的菌落形态以及颜色不同，不同培养基对其他杂菌的抑制作用也不一样，肝脏、脾脏、卵巢可以选择普通营养琼脂、SS、XLT4、胆硫乳琼脂培养基（DHL）、麦康凯、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂(XLD)、煌绿、沙门氏菌显色培养基等，肛拭子、粪便（包括雏鸡胎粪）、肠内容物、垫料、灰尘增菌24h后选择普通营养琼脂、SS、XLT4、沙门氏菌显色培养基效果较好。沙门氏菌显色培养基在选择性培养基中的效果要好于其他鉴别培养，但是价格较高，XLT4能有效抑制其他竞争微生物的生长，特别是变形杆菌的生长，所以在分离环境样品中占有很大的优势。由于不同或同一细菌在不同鉴别培养基上的生长形态都不同，所以传代于鉴别培养基时要选择多种培养基以便于快速得到可疑菌落。沙门氏菌在不同培养基上的菌落形态为：普通营养琼脂上为无色半透明、边缘整齐的圆形菌落；SS平板上沙门氏菌呈圆形、表面光滑、湿润、中心黑色（有些菌株无黑色中心）、边缘透明的菌落；DHL与SS平板上沙门氏菌菌落相似但黑色中心比SS平板上所形成的大一些；XLT4平板上沙门氏菌呈粉红色、中间带有金属光泽的黑色中心、边缘整齐的圆形菌落；XLD与XLT4平板上的沙门氏菌菌落相同；BG平板上沙门氏菌为红色、边缘整齐的圆形菌落；麦康凯上沙门氏菌为无色、中心略带粉色、边缘整齐的圆形菌落。

5 生化鉴定

生化鉴定要选择沙门氏菌鉴定生化管，操作时要确保所检测菌落为纯化后的单一菌株。

6 单因子血清凝集

对分离的可疑菌落先进行A-F多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。被A-F多价 O 血清凝 集 者 ，依次用 O1、O2、O4、O5、O9、O12因子血清做凝集试验根据试验结果，判定O群。每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。不被A-F多价O血清凝集者，先用9种多价O血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的O群血清逐一检查，以确定O群。属于A-F各O群的常见菌型，H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。不常见的菌型，先用8种多价H血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各种H因子血清逐一检查，以第1相和第2相的H抗原。每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果，没有H单因子血清的要用两个H复合因子血清进行核对，检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原的或检出第2相H抗原而未检出第1相H抗原的，可在琼脂斜面上移种1～2代后再检查，如仍只检出一个相的H抗原，要用位相变异的方法检查其另一个相单相菌不必做位相变异检查。单因子血清凝集法能快速准确的对沙门氏菌分型。

7 传统检测方法（国标法）与PCR法

传统的分离方法最终可得到沙门氏菌的纯培养物，方法简单、准确、可重复性强，有一定的灵敏性，但检验程序复杂，耗时较长，一般4～7d。PCR灵敏性高、特异性好、操作简单，出结果较快，但易出现假阳性，操作时首先要确保引物设计质量，如果选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列，靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性，需要重新设计引物。热裂解法提取DNA简单、快捷较为常用，细菌DNA降解与煮沸时间存在一定的正相关性，获得PCR的量于煮沸时间成正相关，在获得同样PCR效果的前提下，煮沸时间越短越好，以2min为宜。

以上阐述了沙门氏菌分离几个环节所需的注意事项，但不能面面俱到，在实验室操作过程中每一步都要求规范、仔细的操作，以得出准确的实验结果。