恶性肿瘤相关静脉血栓栓塞症的生物标志物进展

战翠萍，王 旭，李廷廷，崔久嵬

(吉林大学第一医院 肿瘤中心，吉林 长春130021)

静脉血栓栓塞症是恶性肿瘤发生发展和抗肿瘤治疗过程中的常见并发症，其在不同肿瘤中的发生率可达4%-20%，已成为恶性肿瘤患者死亡的第二大原因。静脉血栓栓塞症可减少恶性肿瘤患者生存期，是恶性肿瘤的独立预后因素。因而及时发现恶性肿瘤相关静脉血栓栓塞症预测因子的变化，有利于评估静脉血栓发生的风险，早期预防。本文着重探讨与恶性肿瘤相关血栓栓塞症的生物标志物，包括较为明确的血小板计数、白细胞计数、白细胞介素、D二聚体/凝血酶原片段1+2、促凝因子FVIII，及新近发现的P选择素、组织因子、微粒、纤溶酶原激活物抑制剂-1及基因多态性等。

1 血小板计数

血小板聚集是血栓形成、止血过程的重要一环。血小板聚集在损伤的内皮细胞，与暴露的细胞外基质蛋白粘附，细胞外基质蛋白再通过血管性血友病因子与血小板受体GP1b-V-IX结合，释放ɑ-和致密颗粒，产生凝血作用。多项研究表明血小板计数升高与肿瘤患者VTE的发生相关，血小板计数可能是肿瘤患者静脉血栓形成的预测因子。维也纳癌症与血栓研究(Vienna Cancer and Thrombosis Study，CATS)纳入了665例恶性肿瘤患者，血小板计数高于第95百分位数(即443*109/L)的患者1年后VTE的累计概率为34.3%，而血小板计数低于443 *109/L的患者VTE的累计概率只有5.9%，在多变量分析中，血小板计数与VTE的发生有统计学意义(HR:3.50,95%CI:1.52-8.06,P=0.0032)，并且发现血小板计数与血小板生成素的水平无关[1]。在Khorana AA等人的研究中，血小板计数与化疗后VTE的发生风险有关[2]。一项诊断肺癌患者的研究发现VTE的发生与血小板计数升高有关[3]。近年有多项研究证实，血小板淋巴细胞比值是恶性肿瘤患者VTE发生的独立预测因子[4,5]。

2 白细胞计数

白细胞参与肿瘤引起的炎症反应，淋巴细胞主要通过表达组织因子引起静脉血栓栓塞症，而中性粒细胞则可能是通过释放中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)促进血栓形成，NETs可聚集血小板和细胞微泡稳定斑块，活化凝血因子XII，亦可灭活组织因子通路抑制剂增加组织因子活性。因此白细胞作为常见的细胞可能与VTE相关，多项研究评估了白细胞增多症在血栓形成中的预测价值。Connolly GC等人[6]在多中心前瞻性研究中分析了4405例实体瘤和淋巴瘤化疗患者的数据，发现化疗前白细胞计数升高的患者，更具体的说，单核细胞和中性粒细胞绝对计数升高的患者VTE发生率较高。一项纳入了946例患者的前瞻性研究发现，瓜氨酸组蛋白H3作为NETs形成的标志物，与癌症患者VTE的发生有关，这也间接提示了中性粒细胞在恶性肿瘤相关血栓形成中发挥着重要作用[7]。

3 白细胞介素

促炎症因子如白介素(interleukin，IL)-1、白介素-6、肿瘤坏死因子-ɑ，可通过诱导组织因子的表达促进凝血状态，从而促进静脉血栓栓塞的发生。在这些细胞因子中，白介素-6起着关键作用。维也纳癌症与血栓研究共纳入了八种白介素，IL-1β、IL-3、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-11、趋化因子配体-3(chemokine ligand-3，CCL-3)，研究发现除了胰腺癌中高IL-1β和IL-6水平与VTE发生有关外，没有发现其他白介素与VTE之间的关联[8]。在卵巢癌患者中，高IL-6水平是VTE发生的独立预测因素[9]。一项针对腹部恶性肿瘤术后患者下肢深静脉血栓形成和细胞因子关系的研究，单因素分析显示高IL-6是DVT的危险因素，而高IL-10水平对DVT具有保护意义[10]。而一项对109例肺腺癌患者血栓风险因素的研究显示， IL-1、IL-6、TNF水平与静脉血栓形成无关[11]。白细胞介素作为炎症因子其与不同类型肿瘤患者血栓形成的关系需进一步探究。

4 P选择素

P选择素(P selectin)是存在于血小板ɑ颗粒和内皮细胞中的一种糖蛋白，通过肿瘤坏死因子-ɑ和白细胞介素-1介导血小板和内皮细胞与白细胞的粘附，尤其是中性粒细胞，从而促进血栓形成。也可与单核细胞表面P选择素糖蛋白配体-1结合，导致细胞表面组织因子的表达，促进纤维蛋白生成。可溶性P选择素的水平与血栓之间有明确相关性，而恶性肿瘤细胞可促进P选择素的表达。CATS结果表明血浆中可溶性P选择素水平是肿瘤患者VTE发生的独立预测因素[12]。Riedl J等人[13]研究了血小板活化的四种标志物(P选择素、可溶性CD40配体[soluble CD40 ligand，sCD40L]，血小板反应蛋白-1 [thrombospondin-1，TSP-1]和血小板因子-4 [platelet factor-4，PF-4])，发现只有P选择素与VTE发生风险相关，高P选择素水平促进静脉血栓形成。在一项前瞻性队列研究中，基线可溶性P选择素水平也被证明是肿瘤患者复发性VTE的危险因素，但治疗期间可溶性P选择素水平与VTE的复发无关[14]。

5 组织因子和组织因子途径抑制剂

组织因子(tissue factor，TF)是一种47 kDa的跨膜糖蛋白，主要表达于皮下基质细胞上和单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞表面，通过与因子VIIa形成复合物引发凝血过程。TF以两种形式发挥作用，一种是微粒形式，另一种是非微粒形式。而TF活性可被TF途径抑制剂(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)抑制。TFPI是一种抗凝蛋白，可以抑制TF/VIIa复合物，从而间接抑制FXa，抑制血液凝固。TF在恶性肿瘤中的异常表达对血栓形成起关键作用，一项卵巢癌相关试验中，发生VTE的卵巢癌患者TF的表达显著升高[15]。TF在不同肿瘤中表达水平不同，在胰腺癌中高表达，因此迄今为止发表的研究中，大量的数据涉及的肿瘤患者为胰腺癌患者。一项研究表明高TF表达的胰腺癌患者VTE发生率是低TF表达患者VTE发生的4倍。TFPI-1作为TF的抑制剂，亦是潜在的生物标志物。一项纳入188例非小细胞肺癌患者的研究表明TFPI-1是非小细胞肺癌患者DVT有价值的预测指标，TFPI-1和D-D测量的组合可以提高非小细胞肺癌患者DVT或转移的预测能力[16]。但TFPI-1的预测能力仍需进一步验证。

6 微粒

微粒(microparticles，MPs)是细胞活化或凋亡时通过胞突出芽释放出的小囊泡，通过因子VII/TF依赖性和非依赖性途径促进凝血。MPs可由白细胞、红细胞、血小板、内皮细胞、平滑肌细胞分泌，在胰腺癌、乳腺癌等恶性肿瘤中，肿瘤细胞也可释放微粒。不同细胞来源的微粒促凝作用不同，且与恶性肿瘤相关静脉血栓栓塞症的关系仍存在争议。微粒可表达不同的物质，如组织因子、磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)、CD51等。Diane Mege等人[17]发现在胰腺癌和结直肠癌中，循环微粒，尤其是携带纤维蛋白的微粒可作为预测肿瘤VTE的生物标志物，且微粒水平高者预后较差。磷酯酰丝氨酸的表达有助于凝血复合物的形成，但两项分别纳入43、728例肿瘤患者的研究发现，PS+微粒不是VTE的预测因子。而表达组织因子的微粒与VTE相关性争议较大。Tesselaar等人[18]的研究表明，与49例无VTE的恶性肿瘤患者相比，51例合并VTE的肿瘤患者的微粒TF活性显著升高。然而，微粒的绝对数量在患者和健康对照之间没有差异，这表明恶性肿瘤患者的微粒富含TF。Manly等人[19]在横断面研究中测量66例不同类型肿瘤患者的微粒TF活性，发现VTE患者的微粒TF活性显著增加。在不同肿瘤类型的比较中，胰腺癌微粒TF活性水平最高，其次是肺癌和结肠癌。但是一项列入186例肿瘤患者的试验结果表明TF+MPs水平升高与VTE无关。近期Chan-juan Cui等人[20]对PubMed,Web of Science和EMBASE数据库中相关文献荟萃分析发现TF+MPs与VTE风险增加有关。

7 凝血因子VIII

凝血因子VIII作为FIX的辅因子，参与内源性凝血途径，激活FX，从而促进凝血酶形成，参与血栓形成。多项研究表明FVIII的水平与肿瘤患者VTE的发生有关，FVIII可作为恶性肿瘤患者VTE发生的预测因子。前瞻性研究CATS结果表明，在发生血栓栓塞事件的患者中，基线FVIII水平显著高于无VTE个体[21]。FVIII升高的恶性肿瘤患者6个月后VTE的累计发生率为14%，而FVIII正常的患者VTE的累计发生率为4%，在年轻的患者中这种关系更明显。另一项纳入不同类型、不同分期的恶性肿瘤化疗患者也得出了相似结论，化疗前高FVIII水平可作为VTE发生的预测指标[22]。对于tamoxifen治疗期间的乳腺癌患者，高FVIII亦会增加VTE发生风险[23]。

8 D二聚体和凝血酶原碎片1+2

D二聚体是交联蛋白的降解产物，当血管内血栓形成或纤溶亢进时，D二聚体即会升高，是目前较为明确的预测VTE的生物标志物。凝血酶原碎片1+2(prothrombin fragment 1+2，F1+2)是激活的FX将凝血酶原转化成凝血酶时产生的，反映了血栓形成过程中凝血酶生成。D二聚体和F1+2水平可作为肿瘤患者新发或复发VTE的预测因子[24]。CATs研究结果显示高D二聚体和F1 + 2水平独立地预测癌症患者VTE的发生。D-D和F1+2同时升高的患者，VTE的发生风险增加3.6倍。且D二聚体和F 1+2在胰腺癌患者中最高，其次为肺癌，在前列腺癌患者中最低[25]。一项纳入18项研究和36种生物标志物的肺癌荟萃分析发现D二聚体是VTE的最强和最可重复的预测因子[26]。对接受化疗的晚期胃癌患者治疗前变量进行分析，D二聚体水平是唯一与VTE发展相关的显著风险因素，可能是VTE危险分层的生物标志物[27]。

9 纤溶酶原激活物抑制剂-1

纤维蛋白溶解的关键环节是纤溶酶原激活物的活化，纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)可以抑制该过程，进而抑制纤维蛋白溶解，促进纤维蛋白的沉积，打破血栓形成与溶解的生理平衡，增加血栓形成的风险。PAI-1在健康人血栓形成中的作用已较为明确，而在恶性肿瘤患者中需进一步证实。Andrén-Sandberg A等人[28]发现在胰腺癌的患者中，PAI-1的水平和活性升高更易使患者发生VTE。一项动物试验研究为了调查抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)治疗对血栓形成的影响，结果发现贝伐单抗通过增加PAI-1表达，促进血栓形成[29]。

10 基因多态性

静脉血栓的形成受外在和遗传因素的影响，相对于外在因素，遗传因素检测结果较稳定，且在静脉血栓形成前即可预测高危风险患者。静脉血栓栓塞症的发生主要由于凝血功能增强、抗凝功能减弱或纤溶异常。凝血功能的增强可见于PT20210A、纤维蛋白原、VIII、IX、X、XI等合成增加，及FVL下调受损。抗凝的功能减弱主要包括抗凝血酶、蛋白C、蛋白S的缺乏或功能紊乱。近年来，越来越多的研究关注遗传易感因素与静脉血栓栓塞症的关系。Gran OV等人[30]对挪威活动性肿瘤患者分析发现，FV基因突变rs6025、rs4524会增加静脉血栓栓塞症的风险。一项纳入297例门诊化疗患者的研究发现VEGF基因-1154G/A、-1154AA与VTE发生相关[31]。对我国恶性肿瘤患者蛋白C相关基因位点分析表明-1654C/T、-1641A/G、1476A/T与VTE发生风险增加相关[32]。而多项关于FVL基因MTHFR C677T与VTE关系的研究结果却存在分歧。Ozkan,M[33]发现MTHFR C677T会增加VTE的发生，而在前列腺癌和肺癌患者中，MTHFR C677T与VTE发生无关[34,35]。现有基因易感性研究皆以高加索人群为研究对象，其在我国恶性肿瘤人群中的突变率及与静脉血栓栓塞症的关系仍需进一步验证。

11 其他

C反应蛋白是一种非特异性炎症标志物，是补体系统的激活剂，肿瘤组织通过浸润单核细胞和淋巴细胞产生C反应蛋白。在一项对507例癌症患者的前瞻性研究中，多因素分析显示C反应蛋白的升高与VTE的发生有关[36]。在另一项包括700例实体恶性肿瘤患者的CATS分析中，C反应蛋白水平较高(> 1.8 mg/dL或高于本队列第75百分位数)的患者在12个月内发生VTE的风险高于低C反应蛋白水平者，且C反应蛋白水平与肿瘤类型有关[37]。

可溶性血管内皮生长因子(soluble vascular endothelial growth factor ，sVEGF)可诱导内皮细胞表达组织因子，进而促进血栓形成。Florian Posch等人[38]测定了不同类型恶性肿瘤中sVEGF水平，发现sVEGF的升高与VTE发生风险增加相关，可能是肿瘤患者VTE潜在的生物标志物。

12 展望

恶性肿瘤相关的复杂病理生理学因素，增加了静脉血栓栓塞症的发生风险，检测血栓形成相关的生物标志物，可以更好的预测静脉血栓的发生概率，尽早发现可能存在的下肢深静脉血栓和肺栓塞，指导血栓的预防和治疗。目前文献报道较多的生物标志物，如D二聚体、组织因子、基因多态性等，受检测方法、受试者种族等多种因素的影响，可能无法准确的预测静脉血栓栓塞症，这就需要我们规范实验室检测方法、寻找不同人群血栓形成的生物标志物，进而联合多种生物标志物建立静脉血栓栓塞症的预测模型，提高对静脉血栓栓塞症的预测能力，这是我们进一步探索的重要内容。