食用菌菌种保藏方法的研究进展*

刘远超，梁晓薇，莫伟鹏，卓丽君，胡惠萍**，黄龙花，谢意珍，2

（1．广东省微生物研究所，省部共建华南应用微生物国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物应用新技术公共实验室，广东 广州 510070；2．广东粤微食用菌技术有限公司，广东 广州 510663）

食用菌营养丰富，风味独特且功效显著，随着生活水平的提高，人们对食用菌的需求量日益增加。据联合国粮农组织（FAO） 统计数据[1]显示，2016年我国食用菌总产量780万t，占全球总产量的70%以上，在农业产业中位居第五[2]，仅次于粮、油、菜、果。食用菌产业的蓬勃发展离不开优质的食用菌菌种，菌种作为生产的源头，其质量好坏直接关系到产品的产量和品质[3－4]。食用菌菌种业中有句俗话：收多收少在于种 （zhòng），有收无收在于种（zhǒng）。这充分说明了优质菌种在食用菌产业中的决定性作用，是食用菌产业能否正常运行的物质基础。菌种选育和菌种保藏都是优质菌种研究的核心，虽然我国科技人员在菌种选育方面做了大量工作，但目前菌种保藏的研究基础还比较薄弱。

1 食用菌菌种保藏方法的基本情况

按照材料可将菌种保藏分为菌丝体保藏和孢子保藏，食用菌菌种保藏中菌丝体保藏方法应用最为普遍，通常通过控制温度、水分、氧气、营养因素（培养基组成），降低或者抑制食用菌的生长代谢以达到菌种保藏的目的[5-6]。按照环境调控可将菌种保藏方法分为：控制含水量的有冷冻干燥保藏法、控制氧气的有矿油保藏法、无菌蒸馏水和盐水保藏法[6-8]，控制温度最为常用的是继代培养低温保藏法和超低温（液氮）保藏法。从现有的研究成果和实践应用来看[9]，短期菌种保藏使用最为广泛的是继代培养低温保藏法，即在继代培养后室温存放1个～2个月或者冰箱（5℃～8℃） 存放3个～4个月，此类方法需要频繁的转接，因此易被污染和退化。长期保藏一般采用超低温（液氮）保藏法，这种方法保存时间可长达8年，但缺点是需要专门的设备且维护费用较高[10]。

评价菌种保藏效果的指标繁多，但归根结底主要在于如何保持菌种的稳定性和防止菌种的退化。菌种保藏目的是要使菌种能够长期地保持稳定而不丢失基因型、表型和生理性状[11]，而退化是指食用菌的某个或某些性状突然或缓慢消失且子代不再重复出现[12]。相关研究表明，在虫生真菌中退化的绿僵菌菌丝体扇形区观察到强氧化应激反应和线粒体DNA改变，涉及脱氧和自我保护的基因表达数量则增多[13]。Chen等[14]用Southern blot分析菌株的核糖体DNA，发现其退化菌株中缺少辅酶A转移酶基因。Magae等[15]对金针菇的研究发现正常和退化菌株在添加了溴百里酚蓝和乳糖的液体培养基中会呈现出不同颜色。李丹青等[16]利用SRAP和SCAR分子标记技术分析了正常菌株与其菌丝退化菌株，标记了疑似草菇的菌丝退化性状基因。菌种退化是目前食用菌栽培中普遍存在的现象，原因除了人为原因，如灭菌不充分、选种和培养不细致等[17]，还有菌种保藏的外界因子和营养成分[18]不合适等原因。

菌种退化原因概括起来主要包括3个方面：一是病毒或细菌感染菌丝体。Magae等[19]和Qiu等[20]研究发现，dsRNA真菌病毒是引起金针菇和糙皮侧耳菌种退化的1个病原体。Krzysztof[21]也表明MVX病毒在多个欧洲国家引起双孢蘑菇子实体畸形等退化现象，导致作物损失严重。通过对秀珍菇正常菌株与退化菌株的双链RNA（dsRNA） 病毒检测，发现退化菌株可能受dsRNA病毒感染，导致其适应环境能力变弱，产量降低[22]。研究香菇真菌病毒LeV发现其能在孢子即有性生殖过程中进行垂直传播，也能在菌丝间进行水平传播[23]。二是遗传因素[24]。根据细胞学和遗传学的观点，细胞分裂周期越短、生长速度越快的生物，发生基因突变的可能性就越高。食用菌细胞分裂和生长速度比动植物更快，因此变异个体存在的几率大幅增加，造成菌种退化或表观性状变化。在退化的草菇菌株中发现，细胞核不对称分裂的比例高于正常菌株，胡锋黎[25]推测这可能是引起草菇菌种退化的重要因素。蛹虫草交配型基因研究发现蛹虫草发生不形成子实体的菌种退化现象的原因之一是核相发生改变，正常菌株为异核体而退化现象菌株为同核体[26]。Horgen等[27]比较双孢蘑菇正常菌株和退化菌株的DNA和染色体差异，观察到了染色体丢失、染色体长度多态性、核糖体DNA重复序列拷贝数变化等。三是继代次数过多，导致基因突变数量增加。李晓[28]对黑木耳的继代和退化关系研究发现，菌丝生长速度、分支数和木屑料分解能力随着继代培养次数的增加而呈现下降趋势。张政[29]也同样在退化的草菇菌株中验证了继代次数的增加，使β-葡萄糖苷酶和漆酶-1基因表达量也随之下降。暗褐网柄牛肝菌也受继代次数的影响，在生产上表现为出菇率下降和单菇重减小，抗杂能力减弱[30]。

环境因素和培养条件尚可通过改善操作环境和技能、筛选培养基配方、严格控制培养环境等方法加以控制，但菌种的继代是难以避免的，继代培养保藏法目前依然是研究和生产中常用的菌种保藏方法，但菌种的一些优良性状会逐渐随着继代培养带来的负向突变而丧失[27，31]。因此，研究人员需要不断探索稳定保藏菌种的方法。

2 国内外食用菌菌种保藏方法的研究进展

国内对食用菌菌种保藏研究起步较晚，研究的种类和试验时间也具有局限性。张婤[32]对547个食用菌菌种开展了无菌蒸馏水4℃冰箱长期保藏的研究，保藏4年后通过纤维素酶活性的检测，结果表明总体成活率达78.87%，但是不同的物种差异较大。现有保藏方法的研究主要针对一些常见食用菌，如平菇 （Pleurotuso streatus）、金针菇 （Flammulina velutipes）、蛹虫草（Cordyceps militaris）、双孢蘑菇（A－garicus bisporus）、香菇 （Lentinula edodes）、羊肚菌（Morchella sp.）、草菇（Volvariella volvacea）、茯苓（Poria cocos）、金福菇（Tricholoma lobayense） 等。

针对平菇菌种的保藏，梁群焘[33]采用梯度降温和防冻剂对保藏效果开展研究，结果认为液氮保藏效果最佳。韩芹芹[34]对降温方式、保护剂、解冻复苏3个步骤设计三因素三水平正交试验，结果认为不加保护剂直接液氮保藏对菌丝体萌发影响最小。

针对金针菇菌种的保藏，杨慧等[35]对保藏在蒸馏水和液氮中长达12年的菌种进行了萌发率、生长速度、纤维素酶酶活性和产量的测定，结果表明2种保藏方法下单瓶产量差异极显著，认为金针菇菌种使用蒸馏水保藏效果更佳。张丹等[36]研究表明金针菇较适宜的短期保藏温度是20℃，－80℃为理想的中期保藏温度。

针对蛹虫草菌种的保藏，林清泉[37]的研究表明退化菌株的脱氢酶酶活性和脱色能力都明显弱于正常菌株；应用RFLP和RAPD分子标记技术和同工酶分析技术对正常菌株和退化菌株进行分析[38]，结果发现退化菌株较野生驯化菌株发生了频率较高的突变，部分同工酶也有明显变异。何晓红等[39]认为蛹虫草退化是因为核型改变、基因突变、胞内有害物质的积累以及病毒的入侵等，防止退化应该从适宜的外界因子包括保藏条件和培养基入手。胡秀彩等[40]也认同菌种的退化与培养条件和转接次数有很大关系。

针对双孢蘑菇菌种的保藏，李洪荣[41－42]将常规保藏与液氮保藏4年的菌种进行对比，测定其存活率、生长速度、酶活力，并通过酯酶同工酶电泳以及PAPD分子检测多个指标，结果表明2种方法间无显著差异，说明液氮保藏可以长期保持菌种的稳定性。

针对香菇菌种的保藏，蔡令仪等[43]以香菇产量为指标比较了液氮保藏和4℃冰箱保藏效果，结果发现液氮保藏的菌种产量更高，但使用前要经活化处理。王玉青[44]的研究也证实液氮保藏对菌种的活力保持效果最好，并提示液氮保藏过程中降温速度对保藏效果影响很大。

针对羊肚菌菌种的保藏，刘兴蓉等[45]认为低温保藏（0～4℃） 的保藏效果要优于常规试管保藏；而侯志江等[46]认为较低温度、有散射光的保藏条件比冰箱保藏的效果更佳。

针对草菇菌种的保藏，陈志宏等[47]认为以超低温液氮保藏效果最好，其次为蒸馏水和矿油保藏，传代培养保藏效果最差。陈明杰等[48]对草菇菌种添加了10%的甘露醇溶液，发现温度4℃保藏的菌种能快速复活且稳定遗传。

针对茯苓菌种的保藏，邵晨霞等[49]、杨祎等[50]以萌发情况和生长速度为指标评价了斜面、木屑管、液体石蜡3种保藏方法下茯苓菌种5年的保藏效果，结果表明斜面低温保藏法适用于短期保藏菌种，液体石蜡保藏法和木屑管保藏法适用于长期保藏。

针对金福菇菌种的保藏，陈志宏等[51]采用了液氮保藏法，从降温速度和解冻温度2个方面进行优化，保藏3个月后，发现梯度降温要比直接放进液氮保藏效果好，最适解冻温度为35℃。

针对灵芝菌种的保藏，李钟庆等[52]对包括灵芝菌种在内的161株担子菌开展矿油密封保存研究，但结果显示此法保藏的灵芝菌种5年以后均失去活力。戴肖东等[53]利用木屑培养基分2批对包括灵芝在内的食用菌开展保藏试验，分别在7年和10年后进行活性测试，结果表明采用此方法菌种都可以存活，但同一灵芝菌株存活率为33．3%，因此认为木屑培养基适合长期保藏食用菌菌种。研究保护剂、解冻方式、降温方法3个因素与灵芝关系发现，各因素对灵芝和杏鲍菇菌丝体生长情况、产量、多糖和三萜影响程度均依次为：保护剂＞解冻方式＞降温方式[54]。

国外早在20世纪60年代就已开展真菌的长期液氮保藏研究，Hwang等[55]通过梯度降温，以10%甘油为保护剂进行液氮保藏，5年后检测发现菌丝体仍可存活且未突变。随着真菌保藏技术的发展，逐渐形成系统的液氮保藏操作流程[56－59]。Homolka 等[60－61]使用珍珠岩作为载体，测试不同属的多种担子菌菌种，以生长速度、漆酶和过氧化氢酶为指标进行测定，结果表明该方法下菌种保藏效果与常规液氮保藏（琼脂为载体）效果相比具有绝对优势。Morris等[62]对20种真菌（包括担子菌、结合菌和子囊菌）在冷冻和复苏时菌丝体的形态进行了比较，结果表明大部分担子菌、结合菌和子囊菌菌丝快速冷冻对菌丝体内的细胞影响较小，即便没有甘油的保护，冷冻后仍然可以存活，但部分卵菌和担子菌则需要甘油作为抗冻剂。Hubalek[63]总结了之前的微生物冷冻保藏过程的保护剂研究情况，认为保护剂效果较好的是二甲基亚砜、甲醇、乙二醇、丙二醇等，但是甘油、聚乙二醇、PVP和蔗糖效果较差。Voyron等[64]分别采用6种低温保藏方法和12种冻干保藏方法对包含灵芝属真菌在内的10种白腐真菌开展研究，以菌丝活力（生长速度、漆酶酶活力和过氧化物酶酶活力）和遗传稳定性（DNA指纹图谱）为测试指标，保藏1个月后，采用6种低温保藏方法的菌种都可以存活，但是12种冻干保藏方法处理的菌种中，只有2种冻干保藏方法下的菌种存活，遗传学分析表明2株灵芝属真菌冷冻保藏后遗传物质的改变率最高，达到26%，认为冻干保藏不适合灵芝属真菌的保藏。Veena等[65]以生长速度为指标对灵芝菌种的保藏进行了试验，结果表明灵芝菌种在高粱培养基上低温储藏（5℃～8℃） 可以保持长达1年的稳定且无污染，然而在普通的培养基上低温保藏却无法生存。Palacio[66]以生长速度、生物量、多糖产量为指标，对灵芝菌种保藏效果进行了研究，结果表明24℃蒸馏水保藏效果最佳，随后是－80℃保藏效果，－20℃和冷冻干燥保藏效果最差，这样的结果与其他超低温保藏有差异，可能的原因是在保藏降温过程中未使用程序降温仪来控制降温的速度，导致－80℃保藏效果弱于24℃蒸馏水保藏。

综上可以得知，国内关于食用菌保藏存在以下问题：对照试验欠缺，保藏时间太短，试验种类不足，试验因子的控制不足，如菌种的菌龄、接种块的大小、培养基类型等，研究内容也十分浅显。国外关于菌种保藏特别是液氮超低温保藏已经形成系统性的操作规程，能够从菌丝块大小、菌龄、降温冷冻和升温复苏的速度、检测指标、防冻保护剂的类型等方面，开展长时间保藏研究，因此结果更科学和实用。大部分研究者认为液氮超低温保藏效果在所有保藏方式中最佳，适合菌种长期保藏，然而仍存在着问题，例如即便是同一物种的灵芝，不同研究人员使用相似的方法，得出的结论也不尽相同。

3 分子生物学技术基础上的菌种保藏研究趋势

随着分子生物学技术的兴起，全基因组测序技术的发展带动了菌种保藏在基因层面上的研究。以灵芝为例，Zhang Xue等[67]研究了热应激对灵芝菌丝体生长的影响，数据表明热应激诱导细胞质钙离子浓度显著增加，因此推断钙离子诱导菌丝生长、灵芝酸合成和热激蛋白的积累，结果表明钙离子参与热激信号转导并调节菌丝体生长。Wu Feng-Li等[68]从灵芝中分离得到了可编码GIPacC的pH响应转录因子PacC/Rim101的同源基因，该基因在中性和碱性条件下高水平转录，该基因的沉默能够损害菌丝体对环境pH的适应，且菌丝分支间距增加，导致生长异常或病变而不能形成原基和子实体，在该基因沉默时，与三萜合成的部分基因表达上调，因此推断GIPacC是一类能够影响菌丝生长、子实体发育和影响三萜合成的复杂功能基因。

目前，灵芝、香菇、黑木耳等全基因组（细胞核和线粒体DNA）序列已经完成测序[69]，针对菌丝生长阶段开展环境因子对菌丝体代谢的影响机理研究，在基因层面已经成为可能。通过对菌种保藏过程中的关键调控基因的发掘，明晰保藏过程中的生理变化及其机理，可为科学、稳定、高效地保藏菌种提供理论支持，最终解决菌种保藏中菌种退化的难题。

4 结语

目前食用菌行业内最为常用的菌种保藏方法是继代培养低温保藏法和超低温（液氮）保藏法。从菌种保藏的研究来看，这两类方法针对不同的菌株有不同的效果，总体来说短期采用继代培养低温保藏法，长期采用超低温（液氮） 保藏法是可行的，但是需要注意的是在超低温（液氮）保藏法中要注意程序降温的方法，尤其是在4℃～-20℃之间，细胞内水分冷冻成冰晶的过程需要采用慢冻的方法。由于液氮保藏在食用菌菌种保藏中应用还不太广泛，所以针对食用菌菌种液氮保藏的研究成果还比较少，需要行业内的科研人员继续努力。在继代培养低温保藏法中则需要注意更换培养基和配合菌种复壮等研究工作，对于高温品种不能用常规的低温保藏，以免菌种失活。因此结合长短期保藏方法能够确保良种的有效保藏，保障产业用种安全。在基础研究领域，运用分子生物学技术，将在基因层面诠释菌种退化的原因并且找到最终解决的方法。