外泌体在乳腺癌中耐药机制的研究进展

张斌，梁爱玲，刘勇军

自 20 世纪 70 年代末以来，全球乳腺癌的发病率一直呈上升趋势。近年来，乳腺癌的发病年龄不断趋于年轻化，我国乳腺癌发病率的增长速度已经超过发达国家增长速度。据国家癌症中心和卫生部疾病预防控制局 2012 年公布的乳腺癌发病数据显示：全国肿瘤登记地区乳腺癌的发病率位居女性恶性肿瘤的第一位。鉴于此，早发现、早诊断与早治疗成为了预防和治疗乳腺癌的关键。随着对乳腺癌生物学行为研究的不断深入，目前已经形成了手术、放疗、化疗、内分泌治疗、生物靶向治疗以及多种辅助治疗为一体的传统治疗方式。化疗作为肿瘤治疗的主要手段，已经广泛应用于肿瘤的临床治疗；但是随着药物治疗的不断进行，肿瘤细胞耐药性是肿瘤治疗中亟需解决的问题。肿瘤细胞耐药性复杂多样，基因的突变、抗凋亡机制的产生、肿瘤细胞微环境的改变均可诱发肿瘤细胞产生耐药。

1 肿瘤微环境

正常组织细胞增殖、分化、凋亡以及细胞间的信息传递都有其自身所处的环境，这种环境在细胞与细胞、细胞与组织不断相互作用中达到动态平衡[1]。肿瘤细胞的增殖恶变打破了这一平衡，肿瘤细胞不断去寻求适于自己生长和繁殖的最适环境，即肿瘤微环境[2]。肿瘤的发生、发展和转移均与肿瘤微环境有关。肿瘤微环境包括肿瘤细胞、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）和间质组织等[3]。进入人体内的化学药物经血液运输到达肿瘤细胞所处的微环境而起作用。2002 年，Weaver 等[4]指出癌细胞与 ECM 黏附结合后，基底膜驱动的三维结构发生极性化的改变，介导肿瘤细胞凋亡保护机制的形成，肿瘤细胞对依托泊苷产生耐受。这说明ECM 在介导肿瘤细胞耐药机制中发挥了重要作用。除ECM 外，肿瘤微环境中其他的肿瘤间质、血管微环境、免疫细胞和免疫分子都参与了细胞耐药性的产生[5]。另有一些研究表明在肿瘤微环境中，组织细胞的 pH 值和药物浓度分布的改变，也会影响化学药物作用的效果，从而促使肿瘤细胞耐药性的产生[6]。

2 外泌体与肿瘤

外泌体是一类直径 40 ～ 100 nm 的双层膜包裹的囊泡[7]。由多种细胞经过“启动-内吞-融合-外排”等一系列过程分泌到细胞外[8]。外泌体在血液、尿液、羊水、唾液、脑脊液、甚至母乳中[9]可以找到，其性质稳定，含有母细胞独特的蛋白质和核酸（包括 DNA、非编码 RNA 和 mRNA），是其母细胞的“缩影”[10]。研究还发现，外泌体具有转运体的功能，可以携带许多功能物质，如脂类、微小 RNA（microRNA、miRNA 或 miR）、mRNA、DNA 片段以及蛋白质（核糖核酸内切酶、Dicer）等[11-13]。外泌体将这些物质转运到受体细胞，从而对受体细胞进行相应调节。这样在肿瘤细胞和远端的细胞或基质细胞间起信息传递作用，使细胞与细胞之间形成了一个相互交联的信号网络，在肿瘤细胞发生、发展以及转移和耐药方面发挥重要作用[14]。

此外，肿瘤细胞分泌的外泌体含有多种细胞因子、生长因子、黏附分子以及胞外基质蛋白等，这些物质在肿瘤细胞的微环境发挥巨大作用，介导了肿瘤细胞和其他细胞间的信息交流[15]。

3 外泌体中 RNA 介导细胞耐药

在肿瘤细胞研究中，原代培养后首次传代得到的细胞系经过一定方法筛选出的分别有不同特征的细胞株对某一化学药物的敏感性常表现出不同，被视为肿瘤细胞异质性的一种表现；根据对同种药物敏感性的不同，将肿瘤细胞分为耐药细胞和敏感细胞两类[16]。研究表明，外泌体作为一种信息传递的介质，其介导的 miRNA 转移可能是细胞间基因传递的新方式，在化疗耐药中起着重要的作用[17]。2016 年，Yu 等[18]在乳腺癌细胞耐阿霉素的研究中发现，与敏感株相比，耐药株中 miR-222 的表达水平显著升高，随后进一步证实，来自阿霉素的乳腺癌细胞的外泌体可通过递送miR-222 来传递耐药性，从而介导敏感株 MCF-7 产生耐药，由此可以说明，MCF-7 敏感株耐药性的变化部分归因于外泌体中携带的 miRNA 的差异。除了 miRNA 之外，2007 年，Valadi 等[19]在对小鼠肥大细胞 MC/9 分泌的外泌体所含 mRNA 的研究发现，来源于小鼠肥大细胞外泌体中mRNA 可以在人和小鼠肥大细胞中自由穿梭，并且这些mRNA 可经外泌体转移到人肥大细胞中产生相应的蛋白质。而在 2018 年，Lv 等[20]在研究从肾小管上皮细胞释放的外泌体 mRNA 的作用中指出，经外泌体传递的 mRNA是可以产生作用的。其在肾损伤机制的研究中表明，急性和慢性肾损伤模型在肾和尿中具有更多的含有炎性细胞因子mRNA 的外泌体，而这种 mRNA 可以从肾小管上皮细胞传递给巨噬细胞，从而导致巨噬细胞炎症反应的增强和迁徙能力的提升。在乳腺癌耐药机制方面，外泌体传递 mRNA用于促进其病理过程还没有明确研究。但为我们研究乳腺癌耐药性机制提供了新的思路。

与 mRNA 相比，miR 在体内（外）更稳定，循环 miR也有助于细胞间信号的转导，并为病理机制研究提供新的靶点[21]；其次，存在于外泌体中的 miR 具有更高的浓度，远高于其在细胞中的表达水平[19]。现已提出外泌体中的 miR-1、miR-17、miR-18、miR-181和 miR-375 在造血作用、胞吐作用、血管的生成和肿瘤的发生等方面有重要作用[22-23]。

4 外泌体中蛋白质介导细胞间耐药性的传递

研究证实外泌体中的遗传物质 mRNA、miR 可以向敏感细胞传递耐药性，使产生耐药[24]。另有研究表明外泌体中蛋白质也参与了耐药性的传递。P-糖蛋白（P-gp）是多耐药基因 1（multidrug resistance 1，MDR1）的表达产物，分子质量为 170 kD，在药物的吸收和分布中起着重要的作用[25-26]。2017 年，许乘凤等[27]研究发现将敏感细胞株MCF-7 组、阿霉素耐药株 MCF-7ADR组和 MCF +MCF-7ADR外泌体（EXOADR）共培养组（MCF-7 + EXOADR）分别培养 12 h 和 72 h，用 Western blot 检测 P-gp 相对表达量，结果显示培养 12 h，MCF-7 + EXOADR组 P-gp 相对表达量比 MCF-7 组升高 4.64 倍（P＜ 0.05）；培养 72 h P-gp 相对表达量比 MCF-7 组升高 3.73 倍（P＜ 0.05）。这说明耐药细胞株的外泌体 P-gp 的表达量要明显高于敏感细胞株 P-gp 表达量；研究者认为耐药细胞株外泌体携带了P-gp，向敏感细胞株传递，引起敏感细胞株 P-gp 水平升高，进而产生耐药，并且认为这种传递可能是外泌体调控肿瘤细胞耐药性的机制之一。

上述研究表明，耐药细胞的外泌体中的 P-gp 可介导敏感细胞耐药性的产生。2017 年，Ning 等[28]研究表明 P-gp表达上调与泛素羧基末端水解酶 L1（ubiquitin carboxyl terminal hydrolase L1，UCH-L1）有关，UCH-L1 是泛素羧基末端水解酶（UCH）家族的一员，在许多肿瘤细胞中表达，并参与癌细胞分化、转移和耐药。研究者发现，MCF-7耐药细胞不仅高表达 UCH-L1 和 P-gp 蛋白，而且还以外泌体的形式将这些蛋白释放到微环境中，将化疗耐药性转移给受体细胞。现已证明，高表达的 UCH-L1 可增强乳腺癌的多耐药性，并且通过激活 MAPK/ERK 信号途径来上调P-gp 的表达[29]。

5 基质细胞外泌体与肿瘤细胞的信号传递

除了肿瘤细胞自身分泌的外泌体可以改变细胞的耐药性外，在肿瘤细胞生长发育所处的微环境中，有些来源于基质细胞的外泌体也可以介导肿瘤细胞对化学药物耐药性的改变[16]。2014 年，Boelens 等[30]研究发现基质细胞与乳腺癌细胞的相互作用会导致旁分泌和近旁信号激活，从而驱动基质细胞介导的耐药。同时，来源于基质细胞的外泌体的 RNA 在乳腺癌细胞中可以激活细胞质中的模式识别受体——维甲酸诱导基因 1（retinoic acid inducible-gene 1，RIG-1）抗病毒信号传导和诱导 Notch3 通路激活，从而产生具有耐药性的肿瘤细胞，进而增殖形成耐药的肿瘤细胞亚群。不仅如此，作为肿瘤微环境主要成分的癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）其已被证实在肿瘤细胞的发生发展、侵袭、转移中发挥重要作用[31]。在此基础上，2017 年，Donnarumma 等[32]分析了其外泌体的释放与乳腺癌细胞侵袭及增殖的关系，其研究结果表明，与正常成纤维细胞相比，CAFs 中差异表达的三个 miR（miR-21、-143 和 -378e）在外泌体中表达增强，当加载至乳腺癌细胞时，它们加强了癌细胞的转移和侵袭，促进了癌症的进展。此外，2014 年，Ono 等[33]研究指出，在临床治疗中切除原发肿瘤后常发生转移性的病灶，而这种病灶相对比较隐匿，肿瘤细胞增殖变缓，患者常无症状。这种类似“休眠”的细胞对传统化疗药物无反应性而表现出耐药。他们的研究还揭示周围骨髓间充质干细胞来源的外泌体可以传递 miR-23b 到乳腺癌细胞中诱导细胞休眠，从而影响细胞的周期并抑制豆蔻酰化富丙氨酸 C 激酶底物蛋白（myristoylated alanine-rich C-kinase substrate，MARCKS）介导的细胞循环和运动，间接地规避药物作用而产生耐药。

6 肿瘤微环境的改变促进外泌体诱导细胞耐药性的改变

有研究指出，肿瘤细胞与正常细胞相比，其细胞外的pH 为酸性。实验证明，这种酸性环境参与了一些囊泡介导的恶性肿瘤细胞的功能调节[34]，2009 年，Parolini 等[35]发现，在酸性条件下，不断增殖的肿瘤细胞，其外泌体分泌和释放量随之增加，并且微环境中的酸度参与了外泌体介导的恶性肿瘤细胞功能的调节，在经质子泵抑制剂处理之后，肿瘤微环境的平衡被打破，其外泌体的吸收和释放随之减少。外泌体的吸收与释放与肿瘤增殖的内在关系，一定程度上说明了细胞外泌体的吸收和释放介导了肿瘤细胞的耐药。除肿瘤的酸性环境之外，晚期肿瘤特征性的低氧微环境也可以介导细胞耐药性产生。2013 年，Corrado 等[36]提出，在低氧条件下，肿瘤细胞被低氧诱导因子诱导，能够代偿性地分泌更多外泌体来介导肿瘤细胞的增殖，逃避迁移至高氧环境，避免凋亡。2012 年，King 等[37]研究表明，低氧环境中的乳腺癌细胞可以被低氧诱导因子 HIF-1α 诱导产生大量的外泌体，从而适应性地介导肿瘤细胞的不断增殖。由此可以得出，低氧的微环境不但可以介导肿瘤细胞耐药性的产生，而且也能够使肿瘤细胞大量分泌外泌体，但低氧环境下外泌体的产生与肿瘤细胞耐药性的相互关系尚未完全得到证实。

7 展望

虽然外泌体在一定程度上有将核酸或蛋白质传递给受体细胞的这种能力，可能使其作为基因治疗载体的理想候选者，也可以作为特异性的生物标记用于早期多种肿瘤的特异性的诊断。然而，随着对乳腺癌研究的不断深入，对外泌体作用机制的阐明，越来越多的证据表明外泌体在生物医学治疗中是一把“双刃剑”，一方面，外泌体本身的生物学性质有助于乳腺癌及其他肿瘤的诊断和治疗；另一方面，由其介导的肿瘤细胞耐药是临床肿瘤治疗遇到的最大挑战。在外泌体与乳腺癌细胞耐药相关的前提下，我们可以从以下几个方面对外泌体介导肿瘤细胞耐药的机制作探究：第一，肿瘤细胞中的外泌体具体分泌方式和作用途径如何；是否与内分泌细胞分泌激素作用途径相类似；第二，是否存在这样一种机制，外泌体中的 mRNA 或者 miR 抑制或者影响其受体细胞中本身的 mRNA 的表达，导致其受体细胞膜蛋白发生变化，从而间接介导肿瘤细胞的细胞膜对某种或某些特定药物通透性的改变而产生耐药性；第三，是否可以通过实验来证实低氧的肿瘤微环境造成的外泌体分泌量的增加一定程度上增强了肿瘤细胞对药物的耐受；最后，在对外泌体作用机制研究的同时，对今后的研究可以致力于在外泌体对肿瘤的诊断、治疗和耐药性之间寻求一种平衡来达到更好的利用外泌体为临床治疗服务的目的。虽然外泌体介导肿瘤耐药的机制尚未完全明确，但目前伴随对外泌体生物特性的了解，对外泌体研究的不断深入，必将会为临床攻克肿瘤疾病提供新的思路。

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