多不饱和脂肪酸微胶囊改善小鼠学习记忆能力研究

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(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

多不饱和脂肪酸(PUFAs)具有重要的生理功能，在生物体的生长、发育及健康等方面都发挥了非常重要的作用，特别是PUFAs在增强及改善大脑学习记忆能力方面尤为突出[1-2].ω-3 PUFAs是大脑组织重要的组成成分，其中二十二碳六烯酸(DHA)占大脑皮层灰质中脂肪酸总量的12%～16%[3].适量的补充PUFAs对各个年龄段人类的大脑认知及学习记忆能力均有提高[4-6].尽管PUFAs制品具有良好的保健功能而被大众所青睐，然而，PUFAs因含有较多的双键，对氧气、光和热极为敏感，易发生氧化而失去其功效[7-9]，添加在食品中容易造成货架期变短或腐败期提前等问题.同时多不饱和脂肪酸一旦氧化，不仅失去生理功能，反而会对人体造成极大的危害[10-12]，因而使其应用受到限制.而采用微胶囊技术可以增加多不饱和脂肪酸的稳定性，提高它在功能性产品中的可用性.

多不饱和脂肪酸微胶囊以明胶与阿拉伯胶为壁材，采用喷雾干燥法将其制备成粉末状多不饱和脂肪酸产品，包封率达到93.15%，负载量为13.68%.氧化稳定性试验表明，原料多不饱和脂肪酸初始过氧化值为0.19 mmol/kg，经65 ℃加速氧化15 d后，未微胶囊化的多不饱和脂肪酸过氧化值增至29.85 mmol/kg，微胶囊化后多不饱和脂肪酸过氧化值仅为4.18 mmol/kg，微胶囊化后多不饱和脂肪酸的氧化稳定性明显提高.但微胶囊化后的多不饱和脂肪酸是否具有与液态多不饱和脂肪酸相同的提高学习记忆能力的作用，相关的研究与报道很少.因此，本实验采用穿梭箱法和Morris水迷宫法，对多不饱和脂肪酸微胶囊改善小鼠学习记忆能力进行研究.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

多不饱和脂肪酸，购自西安欣禄生物科技有限公司，其中二十二碳六烯酸(DHA)质量分数为33%，二十碳五烯酸(EPA)质量分数为22%.多不饱和脂肪酸微胶囊(包封率为93.15%，负载量为13.68%)，实验室自制.吡拉西坦片，上海普康药业有限公司.试验基础饲料，上海斯莱克实验动物有限公司提供.

雄性ICR小鼠，60只，18～22 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司(合格证号：SCXK苏2013-0003).

Morris水迷宫系统，上海软隆科技发展有限公司；BW-MAS104型小鼠穿梭箱，上海软隆科技发展有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物及分组

60只雄性ICR小鼠自由饮水摄食3天以适应环境，按体重每组10只随机分为6组：空白对照组、多不饱和脂肪酸组(500 mg/kg，以体质量计)；多不饱和脂肪酸微胶囊低、中、高剂量组(100，500，1 000 mg/kg，以体质量计)以及吡拉西坦组(300 mg/kg，以体质量计).以上剂量均按药物重量计算，不包括辅料重量.空白对照组小鼠每日灌服等体积蒸馏水，每次给药体积均按0.2 mL/10 g计算，各组灌胃1次/天.给药周期为4周，试验期间动物自由饮水和进食，动物房温度控制在(25±2) ℃，湿度(65±10)%.

1.2.2 小鼠空间学习记忆能力测试(Morris水迷宫试验法)

采用Morris水迷宫试验法[13]，实验装置是由Morris水迷宫和图像监测系统组成.Morris水迷宫装置为直径120 cm，高50 cm的圆形水池.根据直角坐标，水池被等分为4个象限，分别为东北、东南、西北及西南象限，在西南象限正中距池壁33 cm处放有一个高29 cm，直径9 cm的透明圆形平台，平台顶部低于水面1 cm(图1).水温控制在(25±3) ℃.迷宫上空通过摄像机与计算机相连，同步跟踪小鼠在水中的运行轨迹.当已到设定的训练时间或小鼠主动爬上平台，计算机停止跟踪，软件可自动得出小鼠找到平台所需的时间(即潜伏期).给药4周后开始进行小鼠水迷宫训练.1) 定位航行试验：试验历时5 d，训练时将平台置于西南象限，将小鼠分别从池壁4个象限的中点头朝池壁放入水中，记录小鼠找到并爬上平台的时间(即逃避潜伏期)，规定每次训练的时间为60 s.小鼠找到平台后使其在平台上保持15 s，如果小鼠在规定的60 s找不到平台，须将其引导至平台上，让其保持15 s(此时潜伏期记为60 s).取实验前5天的逃避潜伏期，计算其平均值.2) 空间探索试验：在最后一次训练隔24 h后进行空间探索实验，撤去水下平台，记录小鼠在60 s内穿过平台相应位置的次数和停留在西南象限的时间.

图1 Morris水迷宫Fig.1 Morris water maze

1.2.3 小鼠条件学习记忆能力测试(穿梭箱试验法)

采用穿梭箱试验法[14]，首次训练前，将小鼠放入穿梭箱内(图2)3 min，以适应环境.开始训练时，将小鼠放入箱内任何一侧，背朝洞口.一开始先给予蜂鸣音刺激(条件刺激)，持续5 s，蜂鸣音后给小鼠以电刺激(100 V，50 Hz，AC)10 s.如果在蜂鸣音响后5 s内，小鼠逃至另一侧，则为主动回避反应.如果在蜂鸣音响5 s后，小鼠才完成穿梭，则为被动回避反应.若小鼠在蜂鸣音刺激与电刺激结束后仍留在同侧，则为逃避失败.小鼠每天训练10次，每次训练后休息15 s，连续训练5天.记录小鼠被动回避反应时间，并计算主动回避反应率(即主动回避反应次数占穿梭总次数的百分比).

1.2.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 多不饱和脂肪酸微胶囊对小鼠空间学习记忆能力的影响

2.1.1 Morris水迷宫定位航行试验

在第1天训练中，各组小鼠寻找平台的平均潜伏期无明显差异.从第2天开始，随着训练次数的增多，各组小鼠寻找平台的潜伏期均呈下降趋势.多不饱和脂肪酸微胶囊组寻找平台所用时间始终较空白对照组短，随着给药剂量的增多，其小鼠寻找平台的平均潜伏期变短，且高、中剂量的多不饱和脂肪酸微胶囊组能明显缩短寻找平台潜伏期，差异显著(P<0.05).未微胶囊化的多不饱和脂肪酸原料组小鼠寻找平台的用时略高于多不饱和脂肪酸微胶囊组(中剂量)，但无显著性差异(P>0.05)(表1).

表1 小鼠寻找平台的平均潜伏期1)Table 1 Average latency of escaping to the platform for mice

注：1) *与空白对照组相比，有显著差异(P<0.05)；**与空白对照组相比，有极显著差异(P<0.01).同表2，3，4.

2.1.2 Morris水迷宫空间搜索试验

在Morris水迷宫空间搜索试验中，多不饱和脂肪酸微胶囊组(中剂量)小鼠穿越平台次数和在平台所在象限区域游泳时间所占比例高于未微胶囊化的多不饱和脂肪酸原料组，但并无统计学意义(P>0.05).多不饱和脂肪酸微胶囊组小鼠末次穿越平台次数(高、中剂量组差异显著，P<0.05)和在平台所在象限区域游泳时间所占比例(高、中剂量组差异显著，P<0.05)较空白对照组显著增多.多不饱和脂肪酸微胶囊组小鼠大多集中在平台区域附近游动，来回反复找寻目标(表2).

2.2 多不饱和脂肪酸微胶囊对小鼠条件学习记忆能力的影响

2.2.1 主动回避反应率

在前2天的训练中，各组小鼠的穿梭箱主动回避反应率无明显差异.从第3天开始多不饱和脂肪酸微胶囊高剂量组和吡拉西坦组小鼠的主动回避反应率明显增加，与空白对照组相比有显著性差异(P<0.05).多不饱和脂肪酸微胶囊中剂量组和多不饱和脂肪酸组小鼠从第4天开始主动回避反应率较空白对照组显著(P<0.05)提高(表3).且多不饱和脂肪酸微胶囊中剂量组小鼠主动回避反应率始终略高于多不饱和脂肪酸组，但无显著性差异(P>0.05).

表2小鼠末次穿越平台次数及平台所在区域停留时间所占的比例

Table2Frequencyofcrossingtheplatformandproportionofswimmingtimeofmiceinthetargetarea

组别剂量/(mg·kg-1)跨台数量/次停留时间占比/%空白对照组01.80±0.9326.34±8.02多不饱和脂肪酸组5003.01±1.1935.02±10.33微囊低剂量组1002.67±0.7430.53±8.39微囊中剂量组5003.51±1.03*35.19±7.64*微囊高剂量组10003.95±1.07**34.62±5.21*吡拉西坦组3005.13±1.15**41.14±7.28**

2.2.2 被动回避反应时间

由表4可知：未微胶囊化的多不饱和脂肪酸原料组与多不饱和脂肪酸微胶囊组小鼠被动回避反应时间均低于空白对照组.未微胶囊化的多不饱和脂肪酸原料组小鼠动回避反应时间略高于多不饱和脂肪酸微胶囊组(中剂量)，但无显著性差异(P>0.05).多不饱和脂肪酸微胶囊中剂量组从第4天开始，被动逃避时间比空白对照组明显缩短(P<0.05).高剂量组与空白对照组比较，从第3天开始，被动回避反应时间显著缩短(P<0.05).低剂量组被动回避反应时间短于空白对照组，但无显著差别.

表3 小鼠穿梭箱试验主动回避反应率Table 3 Results of the ratio active avoidance response in mice from shuttle box test

表4 小鼠穿梭箱试验被动回避反应时间(n=10)Table 4 Results of the passive avoidance response time in mice from shuttle box test(n=10)

3 结 论

本试验根据《保健食品功能学评价程序和检测方法》(2003版)，通过方向辨别性试验法—Morris水迷宫法与主动回避性条件反射法—穿梭箱法，从不同的角度观察经多不饱和脂肪酸微胶囊给药后小鼠的行为学变化、学习记忆的能力及变化.从整体上评估多不饱和脂肪酸微胶囊的学习记忆作用.穿梭箱结果显示，与空白对照组相比，多不饱和脂肪酸微胶囊各剂量组的主动回避反应率和被动回避反应时间均优于对照组，提示一定量的多不饱和脂肪酸微胶囊能够提高小鼠的主动回避记忆能力.在与学习记忆相关的大脑区域中，海马的作用显得尤为突出，它是被研究的最早以及最多的与学习和记忆有关的脑区[15-16]，其与人或动物的空间记忆密切相关.Morris水迷宫是一种国际上公认的研究与海马功能相关的空间学习记忆模型，可准确的反应受试动物的空间学习记忆能力[17-19].本试验Morris水迷宫结果显示，一定剂量的多不饱和脂肪酸微胶囊能提高试验动物的空间学习记忆能力，以多不饱和脂肪酸微胶囊高剂量组的效果最明显.微囊中剂量组与多不饱和脂肪酸组试验结果差异的显著性分析表明：微囊中剂量组在提高小鼠空间学习以及条件学习记忆水平方面均略优于液态多不饱和脂肪酸组，但均无显著性差异(P>0.05).总之，本试验制得的多不饱和脂肪酸微胶囊具有较高的包封率，可有效提高多不饱和脂肪酸的氧化稳定性，在保持多不饱和脂肪酸原有生理活性的同时还提高了其吸收利用，因此在提高学习记忆能力方面具有非常广阔的应用前景.

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