丹参酮ⅡA对COPD模型大鼠肺组织炎症反应的影响及相关机制研究

俞 凌 陈 晔

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是世界上第四大致死疾病，常伴随病理生理性并发症导致过早死亡，给家庭和社会带来沉重的负担，目前已成为全球公共健康所面临的一个重要挑战[1-2]。COPD的确切病因并不清楚，一般认为其发病机制主要与肺脏对有毒颗粒或气体的炎症反应增强有关。近年研究[3-4]发现，丹参酮ⅡA对心脑血管疾病、肿瘤等具有潜在的治疗作用，表现出多种生物活性，丹参酮ⅡA不管在细胞还是动物模型上均表现出多种抗炎特性。本研究观察丹参酮ⅡA对 COPD大鼠肺组织肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白细胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素 6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素 8（interleukin-8，IL-8）等炎症因子的影响，并探讨其相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级健康雄性SD（sprague dawley）大鼠 40只，实验动物合格证：SYXK（浙）2013-0184，9周龄，体质量150±20g。动物饲养于 12h明暗循环的适宜环境中（光照时间：8:00—20:00），自由摄食饮水。

1.2 实验试剂 脂多糖（LPS）购自美国Sigma公司；烟熏采用香烟（每支含烟碱量为13mg，尼古丁为1.0mg）。大鼠肿瘤坏死因子（TNF）-α ELISA 试剂盒（MultiSciences，批号 70-EK3822/2）、大鼠 IL-1β ELISA 试剂盒（PeproTech，批号 96-900-M91）、大鼠白介素 6ELISA试剂盒（MultiSciences，批号 70-EK3062/2），购自杭州联科公司。大鼠白介素-8ELISA 试剂盒（Maibio，批号 MRK0010-48T），购自上海麦约尔生物技术有限公司。NF-kB p-p65抗体（批号 3034）、Phospho-NF-kB p65抗体（批号 3033）购自CST公司。

1.3 动物分组及给药 将SD大鼠40只随机分为正常对照组、模型组、丹参酮ⅡA低剂量组、丹参酮ⅡA高剂量组，每组10只。从造模第29天至第50天，丹参酮ⅡA低、高剂量组大鼠分别给予腹腔注射1mL/（kg·d）、2mL/（kg·d）的丹参酮ⅡA磺酸钠注射液。对照组和模型组给予大鼠腹腔注射2mL的0.9%氯化钠溶液。每周称量大鼠体质量以调整给药剂量。

1.4 大鼠COPD模型构建[1]大鼠COPD模型制备用气管内滴注脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）联合烟熏法。模型组、丹参酮ⅡA高、低剂量组大鼠每天烟熏2次，两次间隔10h，每次在自制吸烟染毒箱内被动吸烟30支，共50天；其中造模第1天、第28天每只大鼠气道内滴入脂多糖（LPS）0.2mL（200μg），该日内不予烟熏。正常对照组每天在自制吸烟染毒箱内呼吸相同时间的正常空气，并于造模第1、28天每只大鼠气道内滴入0.2mL生理盐水。每次烟熏后，大鼠置于鼠笼内常规饲养。于第52天收集大鼠肺组织进行病理学观察及形态定量分析，确定模型是否建立成功。

1.5 标本检测及方法 实验第52天处死大鼠，解剖游离腹主动脉，腹主动脉取血，注入10mL EP管中，每只大鼠留取5mL血量，室温静置、离心后去上清液，装于5mL EP管中，置-80℃冰箱中保存。大鼠肺泡灌洗液采集：动物处死后，颈部正中切开皮肤，剪开肌肉后暴露气管，眼科剪尖端向心与颈部平面呈30°剪一小口，直径1.5mm塑料软管行气管插管进入2cm，双重棉线结扎固定。沿胸骨打开胸腔，暴露心肺，夹闭右主支气管，注射器吸取生理盐水与气管插管相连。用4℃冷藏的生理盐水灌洗左肺2次，30～60s内缓注4mL，在左肺停留30s后回抽，反复2次后收集肺泡灌洗液，轻揉胸廓促进灌洗液流出，注意动作轻柔，回收率可达90%。4℃ 1000r/min离心10min，上清液-80℃保存待测。ELISA法测定血清和肺泡灌洗液 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平，检测方法按照相应的试剂盒说明进行操作，以标准品的浓度为横坐标，450nm波长的OD值为纵坐标，绘制双对数曲线，根据样品OD值在双对数曲线上计算出其相应的浓度。

1.6 大鼠肺组织病理学观察及形态定量分析 腹主动脉采血后，剖开胸腔，在交叉处结扎左侧主支气管，取出左肺组织，10%福尔马林固定。右肺组织放入-80℃冰箱中保存。结扎右侧主支气管及左上肺支气管并注入4%多聚甲醛至左下肺膨胀，随后将左下肺浸入4%多聚甲醛中固定24h，石蜡包埋、4μm连续切片，进行常规苏木素-伊红（haematoxylin-eosin staining，HE）染色，观察大鼠肺组织炎症细胞浸润情况。

1.7 蛋白质免疫印记检测（Western blot） 用-80℃保存的肺组织提取总蛋白（检测）、核蛋白（检测NFΚb）和胞浆蛋白（检测），Bradford法测定蛋白浓度。5%浓缩胶80V衡压30min，10%分离胶恒压110V，40min，湿转120mA恒流50min，37℃摇床5%BSA封闭 2h，转印后加入一抗：NF-kB（1:1000）4℃过夜。TBST洗膜5min，共3次。山羊抗兔或山羊抗鼠近红外二抗1:15000，常温避光摇床孵育1.5h，避光TBST洗膜15min，共4次。Odyssey V3.0扫描仪扫描膜。重复3次。

1.8 统计学方法 所有数据应用SPSS21.0统计软件分析处理。组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）方法进行数据分析，方差齐采用最小显著差法（least significant difference，LSD）检验，方差不齐者采用Dunnett’s T3检验，结果以（±s） 进行描述。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 丹参酮ⅡA对COPD大鼠肺组织炎症反应的影响 镜下观察可见对照组肺组织未出现明显病理改变及炎症反应，气管支气管管腔正常，无异常渗出物，黏膜下层未见炎症细胞浸润；肺泡完整，肺泡间隔正常且未见炎症细胞浸润。模型组可见明显炎症反应及病理改变，气管管腔呈不规则扩张，平滑肌增厚，内有黏液渗出物，黏膜下层和肌层内可见大量嗜酸性粒细胞及单核细胞等炎症细胞浸润；肺泡间隔增厚，出现塌陷并伴有炎症细胞浸润。与模型组相比，丹参酮ⅡA低剂量组炎症细胞减少，气管管腔内分泌物减少。丹参酮ⅡA高剂量组肺组织结构趋于正常，只有极少量炎性细胞浸润。见图1（封二）。

图1 各组大鼠肺组织病理情况（HE染色，×100）

2.2 丹参酮ⅡA对COPD大鼠血清及肺泡灌洗液炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的影响 模型组大鼠血清及肺泡灌洗液炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量均较对照组明显升高（P＜0.01）。丹参酮ⅡA低剂量组大鼠血清及肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的含量较模型组有所下降（P＜0.05，P＜0.01），但较对照组仍明显升高（P＞0.05）。丹参酮ⅡA高剂量组大鼠血清及肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的含量较模型组明显下降（P＜0.05，P＜0.01），但未完全恢复。见表1～2。

表1 各组大鼠血清 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8比较（pg/mL，±s）

表1 各组大鼠血清 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8比较（pg/mL，±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-1β：白细胞介素-1β；IL-6：白细胞介素-6；IL-8：白细胞介素-8

组别对照组模型组丹参酮ⅡA低剂量组丹参酮ⅡA高剂量组只数10101010TNF-α 117.39±4.89**250.21±12.07197.89±6.56**166.27±4.74**IL-1β 29.91±2.31**50.14±3.0643.11±2.2137.80±2.01**IL-694.50±5.37**167.58±6.01141.05±8.85*122.92±9.04**IL-898.80±5.00**168.90±8.63140.58±8.43*118.84±4.73**

表2 各组大鼠肺泡灌洗液 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8比较（pg/mL，±s）

表2 各组大鼠肺泡灌洗液 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8比较（pg/mL，±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-1β：白细胞介素-1β；IL-6：白细胞介素-6；IL-8：白细胞介素-8

组别对照组模型组丹参酮ⅡA低剂量组丹参酮ⅡA高剂量组只数10101010TNF-α 80.53±4.43**132.45±7.25100.26±3.33**91.07±2.96**IL-1β 25.89±1.34**41.18±2.8934.34±2.5432.87±2.53*IL-666.17±5.01**121.91±6.5195.66±5.64**82.35±4.58**IL-867.32±7.44**116.03±9.3398.925±5.3187.58±6.37*

2.3 丹参酮ⅡA对COPD大鼠肺组织NF-kB pp65表达的影响 通过Image J软件分析获得各组相应灰度值，以GAPDH为内参，计算磷酸化核因子kB p65（nuclear factor kB p65phosphorylation，NF-kB p-p65）和核因子 kB p65（nuclear factor kB p65，NF-kB p65）的相对表达量。与对照组比较，模型组大鼠肺组织NF-kB p-p65表达水平明显升高（P<0.05），即NF-kB明显激活。与模型组比较，丹参酮ⅡA高、低剂量组NF-kB p-p65表达水平明显降低（P<0.05），即丹参酮ⅡA抑制了NF-kB的激活。另外，各组之间NF-kB p65表达量比较无明显差异，即丹参酮ⅡA不影响NF-kB表达总量，见图2（封二）。以上结果表明，丹参酮ⅡA改善COPD及相关炎症反应的作用可能与其抑制炎症反应的中心通路NF-kB的激活相关。

图2 各组大鼠肺组织NF-kB p-p65和NF-kB p65表达比较

3 讨论

丹参酮ⅡA是丹参的有效成分，呈脂溶性，传统观点认为其具有活血化瘀、安神养心的功效，近年来其抗炎、抗菌等作用日趋被重视，是一种潜在的安全性药物。前期研究[5-7]表明，COPD与炎症反应密切相关，其中参与COPD发病的炎症细胞主要为中性粒细胞、巨噬细胞及T淋巴细胞等，此外还有TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等炎症物质。其中TNF-α是目前发现的炎症作用最强的细胞因子，能够直接激活炎症细胞，促使炎性反应进一步扩大，被认为是机体炎性状态的直观反映，也是判定疗效的重要指标[8]。而白细胞介素可趋化中性粒细胞并使其持续活化，进而释放炎性介质，连锁加重炎症[9]。实验应用气管内滴注脂多糖联合烟熏法构建的大鼠COPD模型[10-11]，该模型与人类慢性阻塞性肺疾病在病理生理学上具有相似的改变，可有效的模拟临床病人COPD的发展过程。结果显示，COPD模型组大鼠肺组织有明显的以淋巴细胞为主的炎性细胞浸润现象，且明显促进血清及肺泡灌洗液炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的释放,该现象与前期文献报道一致。而给予丹参酮ⅡA高、低剂量处理后，能明显降低该炎症反应（P<0.05，P<0.01），且呈剂量依赖性。

NF-kB激活是COPD的发病机制中非常重要的环节[12-13]。有实验报道，CODP患者气道上皮NF-kB表达显著增高[14]。另外有研究发现脂多糖进入肺脏后与Toll样受体4（TLR-4）结合，通过髓样分化因子（MyD88）依赖性和MyD88非依赖性两种信号转导途径激活NF-kB和干扰素调节因子3，进一步刺激单核细胞、内皮细胞及中性粒细胞，合成释放一系列炎性介质（如TNF-α、IL-1等），介导气道及肺组织的炎症反应[15-16]。本实验结果表明，模型组与对照组相比，NF-kB显著激活（P<0.05），与之前研究报道的结果一致。进一步与模型组相比，丹参酮ⅡA抑制NF-kB的激活。提示丹参酮ⅡA对炎症因子的抑制作用可能是通过抑制NF-kB的激活所产生。综上，我们认为丹参酮ⅡA能减少COPD大鼠肺组织炎症反应，抑制炎症因子释放，这可能与其抑制炎症反应的中心通路NF-kB的激活相关。

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