初生期和快速生长期梅花鹿茸蛋白表达谱差异分析

张梅 幺宝金 杨永刚 胡耀中 李银清 王群 赵雨

摘 要 采用同位素标记蛋白质相对和绝对定量技术、液相色谱-质谱联用技术和生物信息学分析方法对初生期（15 d）和快速生长期（60 d）东北梅花鹿茸进行蛋白表达谱差异分析，共鉴定出127种差异表达蛋白。其中，与快速生长期鹿茸相比，初生期鹿茸中显著性上调差异表达蛋白49种，显著性下调差异表达蛋白78种。这些差异表达蛋白主要为细胞外基质成分及参与调控神经生长和血液循环进程的功能蛋白。初生期鹿茸主要富含细胞外基质蛋白成分，且在快速生长期鹿茸中表达量显著下调。同时，与初生期鹿茸相比，参与调控神经生长和血液循环的相关蛋白表达量在快速生长期鹿茸中显著上调。这些差异表达蛋白共同参与调控梅花鹿茸的生长速度。本研究结果为进一步揭示鹿茸生长机制提供了基础数据，对研究鹿茸的临床应用具有重要的参考意义。

关键词 梅花鹿茸； 初生期； 快速生长期； 蛋白质表达谱； 差异分析

1 引 言

鹿茸为鹿科动物未骨化密生茸毛的幼角，是哺乳动物中唯一可以循环再生的器官，同时，也是生长速度最快的器官。每年4～5月，鹿角开始脱落，大约15 d后长出新的鹿茸。鹿茸剛开始生长速度较慢，当生长至60 d时，生长速度最快，平均生长速度可达20 mm/d。大约90 d后，鹿茸生长速度开始变慢并逐渐骨化，随后鹿角脱落并开始下一次循环再生[1，2]。鹿茸的活性成分主要包括蛋白质、多肽、氨基酸、多糖和脂类物质等，其中主要成分为蛋白质及多肽[3]。

近年来，越来越多的研究者开始关注鹿茸中具有生物活性的蛋白质及多肽类成分。研究表明，鹿茸蛋白及多肽具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等作用[4～6]，对神经、皮肤、软骨及骨组织损伤具有修复作用[7～10]。因此，针对鹿茸生长和发育过程中的功能蛋白表达谱进行系统和深入研究，有助于进一步揭示鹿茸的再生及快速生长机制。同位素标记蛋白质相对定量和绝对定量（iTRAQ）技术是目前应用较为广泛的蛋白质定量分析技术。通过与液相色谱、质谱技术相结合，实现对不同样本中的蛋白质进行相对或绝对定量，具有简便、快速和通量高等优势，并广泛应用到蛋白质组学研究领域中[11]。靳梦亚等[12]利用iTRAQ结合质谱技术对不同加工工艺鹿茸（鲜品、煮炸、直接冻干等）进行比较蛋白质组研究，共鉴定筛选出87种差异表达蛋白； Dong等[13]采用iTRAQ结合质谱技术从鹿茸骨膜干细胞中鉴定出169种蛋白。然而目前有关鹿茸在初生期和快速生长期的蛋白组学比较的相关研究未见报道。本研究针对梅花鹿鹿茸在初生期和快速生长期这两个时期中的蛋白质组进行了比较，筛选参与调控生长发育的差异表达蛋白，对揭示鹿茸的再生和快速生长机制具有重要意义。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

ZNC-D冷冻粉碎机（北京中科耐驰公司）； 5920R高速低温离心机（德国Eppendorf公司）； Heto PowerDry LL3000 冷冻干燥机（美国Thermo公司）； LC-20AB高效液相色谱仪（日本岛津公司）； nanoACQUITY 超高效液相色谱仪（美国Waters公司）； TripleTOF 5600质谱仪（美国AB Sciex公司）。

鹿眠宝和鹿醒宝麻醉复苏药品（青岛汉河药业有限公司）； PierceTM BCA 蛋白检测试剂盒（美国Thermo 公司）； iTRAQ Reagent 8 Plex One标记试剂盒（美国AB Sciex 公司）； 丙酮、乙腈、甲醇、甲酸等色谱纯试剂（美国Thermo 公司）； 二硫苏糖醇（DTT）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、乙二胺四乙酸（EDTA）、三乙基碳酸氢铵、碘乙酰胺、尿素和胰酶等均为分析纯（美国Sigma公司）。

2.2 实验方法

2.2.1 鹿茸样品采集 选取4周岁健康的雄性东北梅花鹿（吉林省双阳市鹿乡镇）6只，随机分成两组，每组3只。分别于脱盘后15 d和60 d时采集鹿茸顶端生长中心组织（长度约5 cm）。首先，通过注射鹿眠宝3号（0.02 mg/kg）对梅花鹿进行全身麻醉，切取长度约5 cm的鹿茸顶端组织，去除茸皮，经纯化水反复漂洗后，切成1 cm3小块，液氮保存。通过注射鹿醒宝3号（0.02 mg/kg）进行梅花鹿复苏[14]。

2.2.2 蛋白质提取制备 鹿茸组织经低温破碎、蛋白裂解（裂解液： 7 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、1% SDS、1 mmol/L PMSF、2 mmol/L EDTA、10 mmol/L DTT）和低温高速离心（15000 r/min）20 min后，收集上清液。加入终浓度为55 mmol/L 碘乙酰胺，避光反应45 min。经丙酮沉淀（20℃，2 h），15000 r/min低温离心20 min，沉淀溶于0.5 mol/L三乙基碳酸氢铵，用BCA法测定蛋白浓度[15]。

2.2.3 蛋白酶解、同位素标记和分离纯化 称取不同生长时期鹿茸蛋白提取物100 μg，按底物∶酶质量比为20∶1加入胰蛋白酶，37℃酶解4 h； 按相同比例补加胰蛋白酶， 37℃继续酶解8 h，冷冻干燥。蛋白酶解物溶于0.5 mol/L三乙基碳酸氢铵，取出iTRAQ Reagent 8 Plex One Assay Kit 中的113和116同位素标记标签（每个标记标签含有1个活力单位（Unit），可标记100 μg蛋白样品），恢复到室温。加入70 μL异丙醇混匀活化，将活化后的113和116标记标签分别加入到初生期（脱盘后30 d）和快速生长期（脱盘后60 d）鹿茸蛋白样本中，室温孵育2 h。将标记后的各组肽段混合均匀，用LC-20AB液相系统进行肽段液相分离[16]。色谱柱： Ultremex SCX强阳离子交换层析柱（250 mm × 4.6 mm， 美国Phenomenex公司）。洗脱液： 缓冲液 A（25%乙腈，25 mmol/L KH2PO4， pH 2.7）和缓冲液 B（25%乙腈，25 mmol/L KH2PO4，1 mol/L KCl， pH 2.7）。洗脱条件： 混合肽段用4 mL Buffer A溶解，进样后以1 mL/min的速率进行梯度洗脱： 0～10 min， 100% 缓冲液 A； 10～21 min， 5%～35% 缓冲液 B； 21～22 min， 35%～80% 缓冲液 B； 检测波长： 214 nm。根据洗脱曲线收集组分后，经Strata X柱除盐，冷冻干燥。

2.2.4 质谱鉴定 肽段样品溶于2%乙腈-0.1%甲酸溶液中。采用超高效液相色谱（nanoACQUITY）-质谱（TripleTOF 5600）联用进行肽段鉴定[17]。色谱柱： Symmetry C18柱（20 mm×180 μm， 5 μm， 美国Waters公司）和BEH130 C18柱（100 mm ×100 μm， 1.7 μm， 美国Waters公司）。流动相A（水-乙腈-甲酸 = 98∶2∶0.1，V/V）和B（水-乙腈-甲酸=2∶98∶0.1， V/V）。洗脱条件： 首先以流动相A进行肽段样品吸附，流速2 μL/min，洗脱时间15 min； 然后用5% 流动相B以300 nL/min的流速洗脱1 min，最后进行梯度洗脱： 0～40 min，5%～35%B； 40～45 min，35%～80% B； 45～50 min，80% B。质谱仪参数设置： 离子源为Nanospray IIIsource（美国AB SCIEX公司），放射器为石英材料拉制的喷针（美国New Objectives公司）。数据采集时参数设置如下： 离子源喷雾电压2.5 kV，氮气压力为30 psi（14.5 psi≈1 bar），喷雾气压15 psi，喷雾接口处温度150℃； 扫描模式为反射模式，分辨率 ≥30000； 一级单张图谱扫描时间为250 ms，每次采集30个电荷为2+～5+，并且单秒计数大于120的二级图谱，3.3 s为一个循环； 第二个四极杆（Q2）的传输窗口设置为100 Da处效率为100%； 脉冲射频为11 kHz； 检测器的检测频率为40 GHz； 每次扫描的粒子信号以4个通道分别记录共4次后合并转化成数据； 离子碎裂的能量设置为（35±5） eV； 母离子动态排除设置为： 在一半的出峰时间内（约18 s），相同母离子的碎裂不超过2次。

2.2.5 生物信息学分析 液相色谱-质谱分离鉴定后的数据通过ProteinPilot 5.0软件（美国AB Sciex公司）进行分析。由于梅花鹿为非模式生物，因此，将数据与NCBI nr和Swissprot蛋白数据库进行比对，优先选择与梅花鹿或与梅花鹿同源性较高的物种（马鹿（Cervus elaphus）、牛（Bos taurus）、羊（Ovis aries）等）进行比對。同时，选择与两个数据库均成功比对的蛋白进行相对定量分析和差异蛋白筛选。差异蛋白筛选原则为： 当蛋白质丰度差异倍数（Fold change）≥1.5或 ≤0.67，且p值（p value）≤0.05[18]。差异表达蛋白功能富集分析采用AmiGO网络应用程序（http：//amigo.geneontology.org/rte）进行 [19]。

3 结果与讨论

3.1 初生期和快速生长期鹿茸总蛋白制备及差异表达蛋白鉴定

采集初生期期和快速生长期的鹿茸顶端生长组织，经破碎、裂解、离心等步骤提取出鹿茸总蛋白，经BCA法测定初生期鹿茸总蛋白和快速生长期鹿茸总蛋白的浓度，分别为5.415和5.689 μg/μL，体积均为240 μL。通过iTRAQ技术、液相色谱和质谱技术对初生期和快速生长期鹿茸中表达的蛋白质进行鉴定，采用ProteinPilot 5.0软件进行生物信息学分析，共得到236225个二级谱图（Total spectra）。其中，匹配到特有肽段的谱图（Unique Spectra）数量为13494个，鉴定到特有肽段序列（Unique Peptide）数量为5933个，鉴定到的蛋白（Protein）数量为2261个。肽段序列长度分布结果具体见图1，在匹配到的肽段中，绝大多数的肽段包含10～20个氨基酸残基。

通过差异表达分析，共鉴定出差异表达蛋白127种。 初生期与快速生长期鹿茸相比，显著性上调差异表达蛋白49种，显著性下调差异表达蛋白78种（p<0.05， Fold change ≥1.5或 ≤0.67）。

3.2 初生期和快速生长期鹿茸差异表达蛋白功能富集分析

根据iTRAQ鉴定分析结果，首先针对初生期和快速生长期鹿茸的差异表达蛋白进行GO功能富集分析（Gene ontology enrichment analysis）（p≤0.01），结果见图2。通过生物进程（Biological process）功能富集分析，这些差异表达蛋白主要归类为参与调节代谢进程（Metabolic process）、生物调节（Biological process）、应激反应（Response to stimulus）、发育进程（Developmental process）等生物进程的功能蛋白。通过细胞组分（Cellular component）功能富集分析，这些差异表达蛋白主要归类为细胞器组分（Organelle）、大分子复合物（Macromolecular complex）、膜成分（Membrane）和细胞外成分（Extracellular region）等功能蛋白； 通过分子功能（Molecular function）富集分析，这些差异表达蛋白主要归类为结合活性（Binding）、催化活性（Catalytic）、结构分子活性（Structural molecular activity）和分子功能调节（Molecular function regulator）等功能分类。以上结果表明，初生期和快速生长期鹿茸中的差异表达蛋白主要为细胞器和细胞外大分子复合物，并通过结合、催化等方式参与调节鹿茸顶端生长中心细胞代谢、应激和发育等生物进程。

3.3 初生期鹿茸显著性上调差异表达蛋白分析

针对初生期显著性上调差异表达蛋白（p <0.05， Fold change ≥1.5）进行深入分析，发现这些差异表达蛋白主要为细胞外基质类成分，如软骨低聚基质蛋白（Cartilage oligomeric matrix protein）、核心蛋白聚糖（Decorin）、层粘连蛋白亚基α-4（Laminin subunit alpha-4）、聚集蛋白核心蛋白（Aggrecan core protein）和二聚糖（Biglycan）等，结果见表1。软骨低聚基质蛋白是软骨形成和发育过程中重要的细胞外基质蛋白，基因突变和失活常导致假性软骨发育不全（PSACH）和多发性骨骺发育不良（MED）等骨骼系统疾病[20]。核心蛋白聚糖、聚集蛋白核心蛋白和二聚糖是软骨组织中重要的基质成分，主要存在于新生和年轻态软骨组织中[21]。层粘连蛋白亚基α-4是软骨组织损伤修复过程中重要的基质成分[22]。这些结果表明鹿茸在初生期合成和分泌特殊的细胞外基质蛋白，参与调控初生期鹿茸的形成和生长发育，而这些蛋白在进入快速生长期后表达量显著下调。

3.4 初生期鹿茸顯著性下调蛋白分析

针对初生期显著性下调（快速生长期显著上调）的差异表达蛋白（p <0.05， Fold change ≤0.67）进行深入分析，发现这些差异表达蛋白主要包括神经母细胞分化相关蛋白AHNAK（Neuroblast differentiation-associated protein AHNAK）、血红蛋白（Hemoglobin subunit alpha， beta）、铁蛋白（Ferritin heavy， light chain）、 蛋白S100-A2和A10（Protein S100-A2， A10）和结合珠蛋白（Haptoglobin）等，如表2

所示，这些蛋白主要参与调控神经生长和血液循环等生物过程。神经母细胞分化相关蛋白AHNAK通过调节雪旺细胞的形态、迁移以及髓鞘形成进而实现对神经生长和再生的调控[23]。血红蛋白是哺乳动物血液循环系统中的主要氧运载蛋白，但由于其高反应性血红素基团的存在，也使其成为一种潜在的组织损伤性物质。尤其是在出现溶血情况时，血红蛋白被释放到血浆中，作为急性期反应蛋白的结合珠蛋白可以与血红蛋白形成几乎不可逆的非共价蛋白质复合物，进而抑制游离血红蛋白对组织和器官的氧化毒性[24， 25]。铁蛋白是体内贮存铁的主要场所，血清铁蛋白浓度是评价机体是否缺铁或铁负荷过多的有效指标。细胞生长和发育离不开铁的调节，研究表明，在青春期快速生长过程中，需要补充铁蛋白和血红蛋白， 以避免贫血症的发生[26]。蛋白S100-A2和A10作为S100蛋白的家族成员，在软骨组织中表达量较高，主要功能是抑制软骨细胞的肥大分化[27]。这些结果表明鹿茸在快速生长期的血液循环及生长能力旺盛，进而确保鹿茸的快速生长进程。

3.5 代表性蛋白特征肽段二级谱图分析

图3为软骨低聚基质蛋白（Cartilage oligomeric matrix protein）某一特征肽段的二级质谱图。b离子是CONH之间CN键断裂左侧的离子，而y对应是该键断裂后右侧的离子。以CN键计数，从左至右，b离子编号； 从右至左，y离子编号。鉴定到序列为VTSILDWVR，其中y1-10和b1、b3、b4、b6、b9和b10共16个氨基酸碎片离子被鉴定到，利用MASCOT软件分析Peptide score为82.18。

4 结 论

采用iTRAQ技术结合液质联用技术对东北梅花鹿初生期和快速生长期鹿茸顶端生长组织进行蛋白质定性和定量分析，鉴定出多种不同生长时期鹿茸顶端组织差异表达蛋白，阐明鹿茸在初生期和快速生长期发生显著性变化的蛋白成分主要为细胞外基质类成分以及参与调控鹿茸神经生长和血液循环的功能因子。在初生期鹿茸中，多种细胞外基质类蛋白成分如软骨低聚基质蛋白、 核心蛋白聚糖、层粘连蛋白亚基、聚集蛋白核心蛋白和二聚糖等表达量显著上调。当鹿茸进入快速生长期时，这些细胞外基质蛋白表达量显著下调。同时，参与调控神经生长及血液循环过程的相关蛋白表达量显著上调，这些功能蛋白和相关信号通路共同确保鹿茸的生长发育。本研究为全面揭示鹿茸生长机制提供了基础数据，对于研究鹿茸的临床应用具有重要的参考意义。

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