液相色谱—串联质谱前驱离子扫描非靶向筛查卤代有机物

王昆 黄新文 林坤德

摘 要 建立了液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）前驱离子扫描（PIS）非靶向筛查卤代有机物的分析方法。卤代有机物在PIS分析中产生的卤素碎片离子能通过PIS Q3预设的质核比通道（m/z 35、37、79、81和127），根据通过的质核比通道可判断卤代有机物种类，并获取其分子离子质核比信息，而非卤代有机物无法通过PIS Q3的筛选。当Q2碰撞能为50 eV时，PIS对卤代有机物具有较高的灵敏度。利用伯努利概型总结了不同卤代有机物的理论同位素峰数量和丰度比的规律，结合PIS分析结果可判断有机物携带卤素原子数量。本方法成功应用于实验室样品和海水中卤代有机物的筛查，未来有望用于其它环境样品中卤代有机物的快速筛检。

关键词 液相色谱-串联质谱； 前驱离子扫描； 卤代有机物； 同位素丰度比

1 引 言

卤代有机物不仅在自然界中分布广泛，而且对生态系统安全、人类健康有较大的威胁[1]。截至2015年，仅天然卤代有机物就已被发现逾5000余种[2]。部分卤代有机物被证实是环境激素类物质[3]。其中，卤代脂肪烃、多氯联苯、氯代苯酚、含氯农药等多种卤代有机物被美国环保局列为“优先控制污染物”[4]。卤代有机物在自然环境中性质稳定，能長时间残留于水、土壤和底泥中[5]。随着环境中检出的卤代有机物种类不断增加，其环境化学行为、控制方法及生态毒理效应备受关注，而建立准确、高效的卤代有机物分析方法则是进行上述研究的基础。基于液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）和气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）的卤代有机物定量分析方法[6，7]虽然灵敏度高，但通常是针对某种或某类物质，且不具备非靶向筛查能力，导致许多未知卤代有机物无法被及时发现。因此，亟需建立快速、简单的卤代有机物筛查方法。

许多研究已经利用GC-MS、GC×GC-TOF MS检测未知卤代有机物[8，9]，但现行的大部分非靶向筛查方法对极性卤代有机物不具备特异性。基于LC-MS/MS前驱离子扫描（PIS）的分析方法因其能根据目标物携带的特征基团进行非靶向筛查[10～15]而备受关注。Zhang等[11]利用LC-MS/MS的PIS建立了一种饮用水中极性溴代有机物的筛查方法，成功用于饮用水中溴代消毒副产物的筛查。李欢等[14]采用PIS法筛查了溴代苯酚类物质在氯消毒过程中生成的溴代中间产物，发现了一组具有五元环结构的新型消毒副产物三卤代-羟基环戊烯二酮。目前，关于LC-MS/MS的PIS单次进样实现混合卤代有机物的非靶向筛查尚未见报道，值得进行研究。

PIS模式的具体工作原理如下[16]：当PIS Q3 设为m/z 79时，LC-MS/MS的质量分析器Q3只能通过m/z=79的碎片离子。假设未知样品中有含Br的X物质和不含Br的Y物质，两种物质通过离子源电离后形成对应的分子离子X和Y。X和Y依次通过质量分析器Q1时，Q1能够记录其m/z大小。随后进入碰撞活化室Q2与氮气（或氦气）发生碰撞，产生碎片离子。由于X含有Br原子，可产生79Br

和81Br碎片，m/z 79的79Br碎片可通过Q3筛选，在检测器中产生信号，并在PIS谱图中显示其分子离子大小。而Y在Q2碰撞过程中不产生含Br碎片，无法通过Q3筛选，故不会产生信号。由于Br存在天然稳定同位素79Br和81Br，当待测物质在PIS Q3 m/z 79和81下同时产生信号，且结果能反映79Br和81Br的丰度比为1∶1，则认为有溴代有机物检出。同理，当待测物质在PIS Q3 m/z 35和37下同时产生响应，且结果能反映35Cl和37Cl丰度比为3∶1，则可认为有氯代有机物检出。 PIS Q3 m/z 127下产生信号，则认为有碘代有机物检出。由于目前LC-QQQ MS/MS的PIS模式能实现4个PIS Q3 m/z通道的同时监控，本研究尝试采用单次进样实现混合卤代化合物的非靶向筛查。

基于LC-MS/MS的PIS模式，本研究建立了一种简单、快速的卤代有机物筛查方法，结合伯努利概型计算不同卤代化合物的同位素峰数量及理论丰度比，判断卤代化合物中卤素原子的取代个数。本方法成功应用于氯过氧化物酶（CPO）催化生成卤代咔唑以及海水中卤代有机物的筛查。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Infinity 1290型LC-G6490A型QQQ MS/MS（美国Agilent公司）； N-EVAP-111氮吹浓缩仪（美国Organomation公司）； 固相萃取（SPE）装置（上海CNW公司）； KD-300DA数控超声波清洗机（昆山超声仪器公司）。

乙腈、甲醇、正己烷、甲基叔丁基醚（色谱纯，美国Tedia公司）； 甲酸（分析纯，汕头西陇化工公司）； 3-溴咔唑（>97%）、3，6-二溴咔唑（>97%）、3，6-二氯咔唑、己烯雌酚（≥99%）、雌二醇（98%）、己烷雌酚（≥98%），购自美国Sigma-Aldrich公司； 1，3，6-三溴咔唑（>98%）、3-氯咔唑（>98%）、1-溴-3，6-二氯咔唑（>98%）、1，3，6，8-四氯咔唑（>98%）、2，3，6，8-四氯咔唑（>98%），购自加拿大Wellington实验室； 雌三醇（>98%，上海百灵威科技公司）； 苯丙酸诺龙（99%，武汉贝尔卡生物医药有限公司）； 填料量为500 mg的Oasis HLB SPE柱（美国Waters公司）； 0.22 μm PTFE针式过滤器（天津津腾公司）； 实验用水为超纯水（电阻率≥18.2 MΩ·cm，Milli-Q Element系统，美国Millipore公司）。

分 析 化 学第46卷

第11期王 昆等： 液相色谱-串联质谱前驱离子扫描非靶向筛查卤代有机物

2.2 液相色谱-串联质谱测定参数

色谱参数：色谱柱为Agilent Proshell 120 EC-C18柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）； 流动相为水（A）-乙腈（B）； 梯度洗脱程序：0～5 min，5% B； 5～35 min，5%～95% B； 35～40 min，95% B； 40～45 min，5% B。流速为0.2 mL/min； 进样体积为10 μL。

质谱参数分：离子源为电喷雾负离子（ESI-）模式； 分段设置为0～5 min，To waste模式； 5～45 min， To MS模式； 鞘气温度为350℃； 鞘气流速为12 L/min； 干燥器温度为300℃； 干燥器流速为16 L/min； 雾化器压力为35 psi； 喷嘴电压为1500 V； 毛细管电压为4000 V； 破碎电压380V； 碰撞气为高纯氮气（99.999%）； PIS模式时，Q3检测离子设为m/z 35、37、79、81或127，Q1 范围为m/z 100～700，碰撞能为50 eV； 全扫描模式时，范围为m/z 100～700。

2.3 实际样品的采集和预处理

2.3.1 CPO催化生成卤代咔唑实验和预处理 实验方法参照文献[17]。分别取20 μL一定浓度的咔唑标准使用液于1.5 mL Agilent进样瓶中，依次加入100 mmol/L pH 3.0 NaH2PO4/H3PO4缓冲溶液、不同浓度的NaX溶液、5 mmol/L H2O2和10 U/mL CPO，拧紧瓶盖，涡旋振荡混匀溶液，置于温度为（25±1）℃的恒温摇床中避光反应。反应总体积为0.5 mL，咔唑初始浓度为1.0 μmol/L，H2O2和CPO初始浓度分别为500 μmol/L和1 U/mL。待取样时，向体系中加入0.5 mL正己烷-甲基叔丁基醚（90∶10， V/V）进行萃取，静置分层后收集有机相； 重复上述操作2次，合并有机相，氮吹至干，用甲醇定容至200 μL后直接分析。

2.3.2 海水的采集和预处理 2017年6月，在厦门西海域九龙江入海口2个采样站位（A和B）采集表层水样。采集的水样用1 L铝箔纸包裹的玻璃瓶盛装，避光保存运输。样品预处理采用水样中多种有机物同时分析方法[18]，具体操作如下：采用甲醇和超纯水活化HLB固相萃取柱，500 mL待测水样以4～6 mL/min的流速匀速通过HLB柱。上样完毕后，先用6 mL甲醇-水（5∶95，V/V）对HLB柱进行清洗，抽干后，依次用8 mL甲醇、4 mL甲醇-二氯甲烷（50∶50，V/V）洗脱，收集洗脱液，40℃下氮吹，最后用甲醇-水（20∶80，V/V）定容至1.0 mL，经0.22 μm PVDF滤膜过滤后直接分析。

3 结果与讨论

3.1 碰撞能的优化

实现PIS分析的核心是利用碰撞活化室Q2的高纯氮气（或氦气）对待测物质进行碎片化，再筛选出目标m/z。碰撞能越大，待测物质碎片化程度越高，而过高碰撞能会使目标碎片离子进一步破碎。为考察碰撞能的影响，选择5种碰撞能（5、20、35、50和70 eV）进行比较。由图1可见，当碰撞能从5 eV增大至35 eV，卤代有机物的响应不断增强，但随着碰撞能的继续增加，仪器响应趋于稳定，说明碰撞能升高可增加卤代有机物母离子的碎片化，有利于获得Cl和Br碎片。为避免长时间使用高碰撞能对MS寿命的负面影响，后续实验将碰撞能设为50 eV。

3.2 PIS与全扫描模式的比较

向50 μg/L卤代咔唑混合标准品中掺入等浓度的6种雌激素（非卤代有机化合物）作为干扰物质，比较PIS和全扫描两种分析模式对卤代咔唑的筛查效果，结果如图2所示。

由图2A可见，全扫描模式的总离子流图涵盖了包括干扰物质和卤代有机物在内的所有有机物，不具有选择性。另外，当流动相变为高比例有机相（即35～42 min）时，全扫描模式的基线漂移明显，噪声增加，分析时需注意目标物是否被掩盖； 相比之下，PIS的基线平稳，仅有卤代咔唑出峰，能直接排除干扰物质，后期分析工作量小。

以保留时间（RT）32.05 min的MS图为例（图2B），比较了相同保留时间PIS和全扫描模式的m/z干扰情况。在4个PIS Q3 m/z的MS图中，m/z 314.5附近均能观察到一簇同位素峰，且满足一定丰度比规律，由此推断该物质为混合卤代有机物。4张PIS Q3 m/z MS图几乎观察不到其它m/z的干扰，而全扫描的MS图中存在m/z为146.9、197.7、225.9、243.9等众多干扰峰，增加了后期分析的难度。

由此可见，全扫描模式不具备选择性，可以获得更多样品信息，但同时存在背景干扰较大等不足，数据处理阶段需逐一进行甄别，工作量较大； 而PIS模式可根据实际需求，改变PIS Q3的m/z值，调整筛查范围，在筛查携带特征官能团有机物时能取得较好的效果，具有灵活、工作量小等优点。

3.3 PIS分析中氯、溴取代有机物理论同位素峰数及其丰度

在质谱分析中，同位素峰的个数和相对丰度是判断待测物质中卤代个数的重要依据。在自然环境中，35Cl和37Cl丰度比约为3∶1，79Br和81Br丰度比约为1∶1，而I元素的几种天然同位素自然含量差异较大。QQQ这类三重四极杆质谱不能准确测量同位素丰度和丰度比值，低丰度的同位素常被背景噪声掩盖，因此不能根据图谱中的同位素峰数及其丰度关系判断I等同位素丰度差异较大的元素的取代数量。

由于Cl、Br兩种元素都只存在两种天然同位素，每个取代位上的卤素是轻同位素或重同位素互不影响，所以是相互独立事件，因此质谱分析中同位素峰的丰度关系可用伯努利概型计算。以Br为例，若将待测物质的N个同位素峰按m/z从小到大排列，第k个峰代表该物质的N个Br原子中含有k个81Br， 且任一取代位上79Br的概率p79为0.5，81Br的概率p81也为0.5，那么该同位素峰的丰度概率为：

各个同位素峰的概率比值就是该物质同位素峰丰度之比。反过来，实际实验也可通过同位素峰个数及丰度比判断Cl、Br原子的取代数量。

全扫描模式中，含m个Br原子和n个Cl原子的物质在质谱图中会对应产生m+n+1个同位素峰，但实际实验中发现，PIS模式的m/z仅有m+n个同位素峰，相对丰度规律也与全扫描存在不同。下面从纯卤代、氯溴混合取代两种情况，比较PIS模式与全扫描模式的丰度比差异。

3.3.1 纯卤代化合物 以Q3检测的质荷比设定为m/z 79为例，介绍纯溴代化合物理论丰度比的计算过程。当含N个Br原子的目标物的Br原子均为79Br时，其相对分子质量为M。假设该物质进行LC-MS/MS PIS模式分析，则会产生N个同位素峰。若将N个同位素峰按m/z值从小到大排列，第k个峰应含有k-1个81Br原子（1≤k≤N），那么该峰对应的物质相对分子质量为M+2k-2，且含有N-k+1个79Br原子，记为事件A。事件A发生概率可用伯努利概型进行计算，其概率为：

由于全掃描模式中第k个峰对应物质的所有Br原子都被检测，各个同位素峰之间不存在差异，因此常忽略该部分计算； 而PIS模式中，第k个峰对应物质的N个Br原子仅N-k+1个被检测，因此该峰在仪器上产生的响应是全扫描响应的N-k+1N。

因此该同位素的丰度为

将N=1、2、3等整数依次带入算式，可以计算获得不同溴代个数有机物的同位素峰的理论丰度比，列于表1。同理，也计算了PIS Q3 m/z设定为81的理论丰度比。

纯氯代有机物也可采用该方法进行计算。不同的是，Cl原子的两种同位素丰度比为3∶1，化合物任一取代位上35Cl的概率p35为0.75，37Cl的概率p37为0.25。具体结果列于表2。

3.3.2 混合卤代化合物 以PIS Q3 m/z设为 79为例，介绍混卤代化合物理论丰度比的计算过程。假设目标物质携带N个Br原子、H个Cl原子，同时当N个Br原子均为79Br，H个Cl原子均为35Cl时，其相对分子质量为M。该目标物在PIS Q3 m/z 79下将产生N+H个同位素峰，且N个Br原子中至少含有1个79Br。任一同位素对应的物质携带n个81Br原子，h个37Cl原子，那么该物质也携带N-n个79Br原子，H-h个35Cl原子。将同位素峰按m/z顺序从小到大排列，该同位素情况将位于从小到大的第k个峰（1≤k≤N+H），且始终满足n+h=k-1。

将N=1、2、3等整数，H=1、2、3等整数依次带入算式，可以计算获得不同混合卤代有机物的同位素峰的理论丰度比，列于表3。

3.4 方法的应用

3.4.1 筛查CPO催化咔唑生成的卤代产物 用本方法筛查CPO催化卤代咔唑反应过程中的卤代产物，再借助子离子模式对中间产物进行碎片分析，结果如图3和图4所示。由图3A可见，当卤素离子仅为5 μmol/L I时，反应时间为0和16 min的样品中均仅有溶剂峰出现； 而在反应时间为240 min的样品中，RT=5.52 min处有明显的色谱峰，此物质的m/z=291.8。当I浓度升高至50 μmol/L时，反应时间为16和240 min样品在RT=5.52和7.87 min均有物质检出，m/z分别为291.8和417.7（图3B）。根据待测物质在子离子模式下产生的结构碎片及其在PIS Q3 m/z下的出峰情况进行初步鉴定，推测两种物质分别为一碘代咔唑和二碘代咔唑，如图3C～3F所示。虽然I元素不同于Cl、Br元素，不存在丰度相近的天然同位素，但在子离子模式测定中，碘代有机物的谱图中能观察到I原子丢失后的碎片峰，也能判断物质的碘代数量。

鉴于LC-MS/MS的PIS能完成4个PIS Q3 m/z的同时监测，本研究尝试同时进行两种卤代有机物（Cl/Br、Br/I或Cl/I）的组合筛查。将CPO催化反应体系的卤离子调整为Br、I混合，且I和Br初始浓度分别为50和1 mmol/L。当反应时间为0 min时无目标物检出； 而当反应时间为16 min（图4A）和240 min（图4B）时，筛出目标物数量分别为6和5种。随后，对捕获的目标物逐一进行初步鉴定，这8种卤代咔唑分别是-I、-I2、-I3、-Br、-Br2、-Br3、-IBr和-IBr。以RT=7.25 min的中间产物为例（图4C和4D），对鉴定过程进行简单介绍。PIS Q3 m/z 127下能观察到一组m/z 370.8/372.8的同位素峰，在PIS Q3 m/z 79和81下各观察到一个同位素峰，m/z分别为370.8和372.8，且同位素丰度比均为1∶1，说明此物质含有一个Br原子和至少一个I原子。再通过解析其在子离子模式下产生的碎片，发现此物质有且仅有一个I原子，故推测该物质为一溴一碘混合卤代咔唑。

根据文献[17，19]的GC-TOF MS和GC-MS分析结果，在仅含Br的反应体系中，CPO能够催化咔唑先后生成一溴取代咔唑、二溴取代咔唑等溴代咔唑，而在Br、Cl混合的反应体系中，CPO既能催化咔唑生成单卤代咔唑，也能生成混合卤代咔唑，这与本研究的筛查结果一致。

3.4.2 筛查海水中的卤代有机物 环境水体中的卤代有机物不仅种类繁多，结构和性质差异明显，浓度水平普遍较低（ng/L级别甚至更低），因此采用PIS模式分析前须对水环境样品中的有机物进行富集。富集方法参照水样多种有机物同时分析前处理方法[18]，选择宽极性范围的Oasis HLB柱作为富集材料，对水环境样品中有机物质进行富集。在PIS Q3 m/z设为35、37时，站位A、B采集的样品均无目标物检出； 而当PIS Q3 m/z设为79、81时，A站位可以筛查到溴代有机物，站点B无检出（图5A和5B）。根据目标物在PIS下的m/z情况，发现A站位检出的两种溴代有机物分别为二溴代有机物（图5C）和三溴代有机物（图5D），但由于样品浓度较低、缺少其它特征碎片离子作辅助定性、质谱分辨率有限等原因，无法进一步推测其详细结构。Zhang等[11]在建立PIS模式筛查极性溴代有机物方法时，直接进样，并未选择色谱作为前端分离手段。但由图5可见，在PIS Q3 m/z 79的通道上存在一定的仪器干扰或环境基底干扰，若不采用色谱进行分离，可能造成样品假阳性。未来的实际应用中，仍需将色谱和PIS结合使用，以达到最佳分析效果。

References

1 JIN Li-Juan， CHEN Bao-Liang. Prog. Chem.， 2017， 29（9）： 1093-1114

金梨娟， 陈宝梁. 化学进展， 2017， 29（9）： 1093-1114

2 Gribble G W. Environ. Chem.， 2015， 12（4）： 396-405

3 Katsoyiannis A， Samara C. Environ. Res.， 2005， 97（3）： 245-257

4 Keith L，Telliard W. Environ. Sci. Technol.， 1979， 13（4）： 416-423

5 Bigot M， Hawker D W， Cropp R， Muir D C G， Jensen B， Bossi R， Nash S M B. Environ. Sci. Technol.， 2017， 51（16）： 8944-8952

6 Dofour P， Pirard C， Charlier C. J. Chromatogr. B， 2016， 1036-1037： 66-75

7 Chi X Y， Liu J Y， Yu M，Xie Z Q， Jiang G B. Talanta， 2017， 164： 57-63

8 Hauler C， Vetter W. Rapid Commun Mass Spectrom.， 2015， 29（7）： 619-628

9 Ubukata M， Jobst K J， Reiner E J， Reichenbach S E， Tao Q P， Hang J L， Wu Z P， Dane A J， Cody R B. J. Chromatogr. A， 2015， 1395： 152-159

10 Steen H，Kuster B， Fernandez M， Pandey A， Mann M. Anal. Chem.， 2001， 73（7）： 1440-1448

11 Zhang X R， Talley J W， Boggess B， Ding G， Birdsell D. Environ. Sci. Technol.， 2008， 42（17）： 6598-6603

12 Liu P， Huang Y Q，Cai W J， Yuan B F， Feng Y Q. Anal. Chem.， 2014， 86（19）： 9765-9773

13 Crevelin E J， Possato B， Lopes J LC， Lopes N P， Crotti A E M. Anal. Chem.， 2017， 89（7）： 3929-3936

14 LI Huan， LI Zheng-Kui， LI Ai-Ming， ZHOU Qing， WANG Ying， PAN Yang. Environ. Sci.， 2017， 38（8）： 3273-3280

李 欢， 李正魁， 李爱民， 周 庆， 王 莹， 潘 旸. 环境科学， 2017， 38（8）： 3273-3280

15 Du L L， Xue Y， Xie J. Chromatographia， 2018， 81（5）： 769-776

16 Pan Y， Zhang X. Environ. Sci. Technol.， 2013， 47（3）： 1265-1273

17 Chen Y Q， Lin K D， Chen D， Wang K， Zhou W X， Wu Y， Huang X W. Environ. Pollut.， 2018， 232： 264-273

18 LIN Shan-Shan， YI Qi-Tong， HONG Jia-Jun， CHEN Meng， YUAN Dong-Xing. Chinese Journal of Chromatography， 2013， 31（10）： 980-988

林姍姗， 易启同， 洪家俊， 陈 猛， 袁东星. 色谱， 2013， 31（10）： 980-988

19 Mumbo J， Lenoir D， Henkelmann B， Schramm K W. Environ. Sci. Pollut. Res.， 2013， 20（12）： 8996-9005