液相色谱—稳定同位素质谱联用鉴定咖啡饮料中咖啡因天然来源

丁博 王志元 陈文锐 谢建军 佘志刚

摘 要 建立了液相色谱-稳定同位素质谱联用 （LC-IRMS）检测咖啡因的δ13C分析方法，用于鉴定咖啡饮料中咖啡因天然来源的真实性。样品中咖啡因经液相色谱分离纯化，色谱条件为： XBridge Shild RP C18色谱柱（50 mm × 2.1 mm， 3.5 μm）， 柱温50℃，流动相为超纯水，流速400 μL/min； 再通过LC-IsoLink实现目标物全部氧化为CO2气体，最终以气态形式进入稳定同位素质谱仪，直接检测样品中咖啡因的δ13C。检测44个不同产地来源的咖啡豆样品中咖啡因的δ13C，其范围是25.3‰～30.9‰， δ13C平均值δaverage=27.9‰， 标准偏差s=1.3‰，以3倍δ13C标准偏差s为判断依据，检测16个咖啡饮料样品的咖啡因δ13C，结果表明，1个咖啡饮料样品中咖啡因δ13C在3倍标准差线附近（δaverage-3s， 31.7‰）， 判别其咖啡因为非咖啡豆来源。LC-IRMS同位素质谱测定咖啡因δ13C的分析方法，可用于鉴别咖啡饮料天然来源的真实性。

关键词 液相色谱-稳定同位素质谱联用； 咖啡饮料； 咖啡因

1 引 言

咖啡和咖啡飲料是常见的饮品[1]，具有提神的作用，其主要功效成分是咖啡因[1]。适量摄入咖啡因能振作精神、增强思考能力、提高心脏功能、缓解肌肉疲劳[2，3]。饮用天然咖啡因比人工合成咖啡因更加健康，因为人工合成咖啡因可能会导致焦虑症、睡眠失调等副作用[4，5]。伴随着天然咖啡因需求量增大，其导致价格越来越高，一些不法厂商以人工合成咖啡因替代天然咖啡因。如何鉴别天然咖啡因与人工合成咖啡因，是咖啡饮料天然成分鉴定的关键技术难题。

稳定同位素技术是食品掺杂和溯源分析领域一项重要技术，尤其是特定化合物同位素分析技术开发应用的完善，使同位素质谱技术在食品领域得到迅速的发展[6，7]。气相色谱-同位素质谱（GC-IRMS）与液相色谱-同位素质谱（LC-IRMS）是两种主要的特定化合物同位素分析技术，广泛应用于环境科学和食品科学等领域[8]。GC-IRMS由于具有良好的接口串联技术，在食品掺杂与溯源分析领域应用广泛，GC-IRMS主要适用于挥发性或半挥发性目标物同位素质谱分析[9，10]。与GC-IRMS同位素质谱技术相比， LC-IRMS同位素质谱技术可应用于非挥发性有机物的测定，尤其是不需要衍生化直接进行同位素质谱分析[11]。自2004年赛默飞公司推出第一款市场化的LC与IRMS串联接口LCisoLink[12]以来，LC-IRMS同位素质谱技术开始应用于考古学、地球化学、环境科学、食品鉴定等领域。McCullagh等[13]采用LC-IRMS检测人和动物骨头中氨基酸的δ13C，利用复合型色谱柱，硫酸溶液为流动相，室温条件下分离15种氨基酸，IRMS测定氨基酸的δ13C，最终重现古代人和动物的饮食结构； Powers等[14]运用LC-IRMS检测天然水中碳同位素比，以此定量分析水体中溶解无机碳含量，以及水体中溶解有机碳光化学作用的转化率。Basler等[15]利用LC-IRMS检测土壤中单糖的δ13C，通过单糖碳同位素比探讨土壤不同碳水化合物动态变化； Cabaero等[16]运用LC-IRMS检测蜂蜜中蔗糖、果糖和葡糖糖的δ13C，结合EA-IRMS检测蜂蜜中蛋白质的δ13C，鉴别C3植物蜂蜜是否掺杂C4植物糖。尽管LC-IRMS同位素质谱技术已在地球科学和食品科学领域得到应用，但是LC-IRMS同位素质谱技术在应用中仍然存在很大问题，如色谱流动相必须为纯水体系、 不能用有机流动相、 液相色谱柱选择受限，严重影响LC-IRMS同位素质谱技术的实际应用。

为了克服LC-IRMS同位素质谱技术必须采用水相流动相而导致色谱分离洗脱能力低的问题，研究者通过提高色谱柱柱温的方式增大水溶液的洗脱效率。Godin等[17]首先将此方法用于LC-IRMS中，利用磺化聚苯乙烯-苯二乙烯聚合柱和多孔石墨化柱两根色谱柱高温分离对香豆酸和阿魏酸等酚酸化合物，聚合柱温度保持在90℃，多孔石墨化柱最高温度升至170℃，IRMS测定酚酸特定化合物的δ13C。 Zhang等[18]在150～200℃高温条件下，采用Xbridge、Acquity、Triart和Zirchrom PBD等不同厂家反相C18色谱柱，以纯水为流动相，分离苯酚和咖啡因等化合物，用IRMS检测这些特定化合物的δ13C。Kujawinski等[19]利用LC-IRMS检测磺胺类药物的δ13C，选择Xbridge C18色谱柱，柱温60～100℃，磷酸盐缓冲溶液为流动相，洗脱磺胺类药物。研究表明，反相C18色谱柱在高温纯水流动相条件下，色谱峰扩展甚至趋于扁平，C18色谱柱不能长时间在高温条件下使用[20，21]。

20世纪60年代，科研人员通过放射性碳同位素分析鉴别饮料中咖啡因天然或人工合成来源[22]。2003年， Richling等[24]利用EA-IRMS离线检测瓜拉纳饮料、茶叶、咖啡饮料咖啡因的δ13C，样品首先通过分析型液相色谱仪分离提取获得的咖啡因单体化合物，纯咖啡因化合物引入EA-IRMS同位素质谱仪，测定获得咖啡因的δ13C，从而鉴别饮料中咖啡因是否为天然来源。2012年，Zhang等[18，24]利用LC-IRMS同位素质谱仪在线检测饮料中咖啡因的δ13C，选择Xbridge C18色谱柱，柱温30～180℃，检测咖啡因的δ13C。本研究基于高温液相色谱联用LC-IRMS同位素质谱技术[17，18]，探讨LC-IRMS同位素质谱在线检测咖啡豆、咖啡饮料中咖啡因的δ13C。结果表明，Xbridge C18色谱柱柱温超过70℃后，色谱峰变宽而偏平，色谱柱寿命锐减，因此，选择在纯水流动相和恒温条件下，以Xbridge shild RP C18色谱柱分离咖啡因，优化色谱柱的长度与粒径，获得最佳LC-IRMS在线分析条件，用于天然咖啡豆和咖啡饮料中咖啡因的δ13C值的测定，分析咖啡因δ13C数据，判断咖啡饮料中咖啡因天然来源的真实性。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Dionex UltiMate3000 型高效液相色谱仪、DELTA V Advantage 同位素质谱仪和 FINNIGAN LC IsoLink接口（美国 Thermo Scientific 公司）； Milli-Q 超纯水仪（美国 Millipore 公司）；SW 30H 型超声波仪（瑞士 SONO公司）；SIGMA 3-30KS 高速冷冻离心机（德国 Sigma公司）；Sartorius BT 223S天平（德国赛多利斯公司）。

咖啡因同位素标准物质为IAEA-600（δ13C=27.77‰ ± 0.04‰， 购于国际原子能机构）； Na2S2O8、 H3PO4等均为分析纯（美国Sigma-Aldrich公司）； 实验用水为超纯水（18.2 MΩ·cm） 。

合成咖啡因样品（1000 mg/L于甲醇，上海安谱公司）；咖啡豆样品和饮料购于广州市大型超市。

2.2 样品前处理

咖啡豆用瑙碾钵研磨粉碎，准确称量0.500 g 样品于50 mL离心管中，加入25 mL超纯水，振荡1 min使其混合均匀，超声提取30 min，10000 r/min离心5 min，取约1 mL上清液，过0.45 μm滤膜至1.5 mL样品瓶，用超纯水稀释5倍，进行LC-IRMS测试。

取5 mL咖啡饮料样品，用超纯水稀释至50 mL，10000 r/min离心5 min，取约1 mL上清液，过0.45 μm滤膜至1.5 mL样品瓶，待LC-IRMS测试。

2.3 LC-IRMS检测方法

液相色谱条件：使用Waters XBridge Shild RP C18色谱柱（50 mm × 2.1 mm×3.5 μm）；流动相为超纯水，流速400 μL/min；柱温为50℃；进样量10 μL。

LC-IsoLink气液分离条件：样品从LC色谱洗脱分离出来，在氧化反应管中与4%Na2S2O8溶液和4%H3PO4溶液混合， 在98.5℃条件下，目标化合物全部氧化为CO2，经过气液在线膜分离单元分离后导入IRMS中。

同位素质谱条件：离子源电压为3.05 kV，電流为0.72 mA；载气为高纯氦气，压力为150 kPa；参考气CO2压力为190 kPa；真空度1.5 × 104 Pa ，法拉第杯检测器接收质量数为44、45和46目标离子。

2.4 δ13C值的计算方法

样品测定时，每个样品的分析起始阶段和结尾阶段通入高纯CO2参考气体作为内标，然后用已知δ13C值的咖啡因标准溶液标定高纯CO2参考气体的δ13C，再以CO2参考气体的δ13C值为标准，对样品中咖啡因的δ13C值进行计算。采用Isodat3.0软件对数据进行分析。

咖啡因标准溶液的δ13C的计算基于国际标准物质VPDB，计算公式为[25]：

2.5 统计分析

采用Origin 8.5 软件（美国 OriginLab公司）分析咖啡样品检测所得的δ13C数据，咖啡、咖啡豆、生咖啡豆、咖啡粉和咖啡饮料等不同类别样品的咖啡因δ13C利用SIMCA 14.0软件（瑞士 Umetrics公司）进行主成分分析。

3 结果与讨论

3.1 分离条件优化

3.1.1 色谱柱的选择 LC-IRMS同位素质谱分析中，液相色谱柱的选择是关键因素，文献[26]研究了XBridge BEH C18、Acquity UPLC BEH、Triart C18和Zirchrom共4种型号液相色谱柱， 在高温纯水流动相条件下，其中Waters公司的XBridge C18的色谱柱对样品中δ13C值的测定影响最小。本研究选择XBridge BEH C18和Xbridge shild RP C18两种类型的色谱柱分离咖啡豆及咖啡饮料中咖啡因，比较不同长度以及填料粒径（XBridge BEH C18 （50 mm × 2.1 mm， 2.5 μm）、XBridge BEH C18 （50 mm × 2.1 mm， 3.5 μm）、 XBridge BEH C18 （100 mm × 2.1 mm， 3.5 μm） 和XBridge shild RP C18 （50 mm × 2.1 mm， 3.5 μm） ）4种规格的色谱柱。结果表明，4种规格色谱柱均能实现咖啡因的分离。柱温恒定条件下，选择XBridge BEH C18色谱柱 （50 mm × 2.1 mm， 2.5 μm）分离咖啡因时，系统压力过大，连续检测样品时，常发生压力过大导致液相泵停止工作的情况；XBridge BEH C18（50 mm × 2.1 mm， 3.5 μm）和XBridge BEH C18 （100 mm × 2.1 mm， 3.5 μm）分离咖啡因时，咖啡因保留时间较长，尤其是后者，色谱分离时间甚长，批量检测样品耗时，影响样品检测效率。Xbridge shild RB C18类型色谱柱适合纯水流动相体系，色谱分离水溶性化合物分离度高，保留时间短。因此，选择XBridge shild RP C18 色谱柱（50 mm × 2.1 mm， 3.5 μm）在恒温纯水流动条件下分离咖啡因 （图1）。

3.1.2 流速与柱温的选择 LC-IRMS同位素质谱测定目标化合物的稳定碳同位素比，要求色谱流动相不含甲醇或乙腈有机洗脱液，因此实验选择超纯水为流动相。LC Isolink气液分离单元允许最大流速500 μL/min，其中氧化剂和酸化剂总流速最大值为100 μL/min，因此，选择咖啡因色谱分离流动相流速为400 μL/min。

高温条件下，纯水可以达到甲醇和乙腈有机溶剂的洗脱能力[27]，因此通过提高纯水流动相的色谱柱柱温，实现咖啡因目标物的分离。XBridge shild RP C18耐受最高温度为60℃，柱温选择50℃，以纯水流动相分离咖啡因目标物，长时间使用后，咖啡因同位素质谱目标峰未变宽。因此，LC-IRMS检测咖啡因的δ13C分析条件为： XBridge shild RP C18色谱柱（50 mm × 2.1 mm， 3.5 μm）、柱温50℃，纯水为流动相。

3.2 天然咖啡因同位素質谱分析

从市场随机购买44种咖啡豆与咖啡样品，分别是18种咖啡饮品、11种咖啡豆、7种生咖啡豆和8种咖啡粉，用LC-IRMS同位素质谱分析，咖啡因的δ13C值测定结果见表1。咖啡豆及咖啡天然来源的咖啡因δ13C值范围在25.3‰～30.9‰之间，利用t分布统计学分析44种样品的咖啡因δ13C平均值27.9‰， 标准偏差s=1.3‰。同时检测人工合成咖啡因的δ13C值在35.8‰～38.5‰之间。Weinkauff等[22]采用EA-IRMS 检测天然来源茶叶咖啡因，δ13C值在27.7‰～31.7‰之间，天然来源咖啡中咖啡因的δ13C值在26.5‰～27.5‰之间，天然来源瓜拉纳种子中咖啡因的δ13C值在26.7‰～28.7‰之间，人工合成咖啡因的δ13C值在37.9 ‰～40.0‰之间。因此，本方法检测天然来源及人工合成咖啡因咖啡因的δ13C数据与文献[22]报道数据一致。

由图2可知，咖啡、咖啡豆、咖啡粉和生咖啡豆中咖啡因的δ13C值在2倍标准偏差范围之内，生咖啡豆或烘烤不同类别样品中咖啡因保持一定稳定性。因此，可以根据天然来源咖啡产品的咖啡因δ13C值分布规律鉴别咖啡饮料中咖啡因是否来源于天然咖啡豆。

3.3 咖啡饮料中咖啡因的测定

采用建立的LC-IRMS同位素质谱测定咖啡因的δ13C分析方法，测定市售的16种咖啡饮料中咖啡因的δ13C（表2）。由表2可知，16种咖啡饮料中咖啡因δ13C值与咖啡豆、咖啡等天然来源咖啡因δ13C值比较相一致，咖啡因δ13C值在1倍标准偏差下限值范围之内，其中只有1种香浓咖啡饮料的咖啡因δ13C值为31.7‰， δ13C值在咖啡豆、咖啡等天然来源咖啡因的1倍标准偏差和3倍标准偏差之间，接近3倍标准偏差下限临界值（31.8‰），人工成咖啡因δ13C值在35.8‰以下，推断此香浓咖啡饮料中咖啡因是非咖啡豆天然来源的咖啡因。

将44个样品分为咖啡豆、咖啡粉、生咖啡豆和咖啡4种天然来源产品，以及1种咖啡饮料产品，LC-IRMS测试所得咖啡因δ13C值按照5种类别产品类别进行主成分分析（图3）。由主成分分析结果可知，不同类别咖啡产品的咖啡因δ13C值相对聚集，其中咖啡豆、生咖啡豆和咖啡3种产品相对聚集在一起，咖啡粉与咖啡饮料2种类别产品聚集在一起，由此推测，咖啡饮料为糊状悬浮液与咖啡粉产品加工工艺程序比较接近，碳稳定同位素分馏效应相似，导致它们咖啡因的δ13C值相对分布集中。

4 结 论

建立了LC-IRMS同位素质谱直接测定咖啡因δ13C值的分析方法，用于咖啡、咖啡豆天然来源咖啡因和咖啡饮料中咖啡因的测定。以天然来源咖啡因的δ13C值分布范围为依据，用于鉴别咖啡饮料中咖啡因是否为天然来源。LC-IRMS同位素质谱技术在食品溯源及品质鉴定中具有良好的应用前景。

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