食品中致病菌快速检测技术研究进展

□ 付伟超 商丘市质量技术监督检验测试中心

1 分子生物学方法

1.1 聚合酶链式反应（PCR）

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）作为常见的一种分子生物学技术，其是在体外对特定的DNA片断进行放大扩增，然后对其扩增产物进行检测。在食品致病菌检测领域，使用PCR技术对特异DNA片段进行扩增从而快速地检测食品中的致病菌，能够同时分析多种致病性微生物，且速度快、灵敏度高，尤其适合人工无法培养或者培养难度较大的微生物。PCR技术虽然具有高灵敏度的优点，但是由于其存在技术缺陷，还不能从根本上替代常规的检测方法。首先是假阳性和假阴性问题，核酸污染是造成假阳性的主要原因，食品中复杂的成分能够抑制PCR反应导致假阴性。其次就是定量检测较为困难。因此，这也限制了PCR技术在致病菌检测中的推广使用。

1.2 基因芯片（Genechip）技术

作为一种大规模、高通量核酸分子杂交测序方法，基因芯片通过微加工技术将一系列已知次序探针固定于支持物表面，形成高密度的寡核苷酸阵列，被测食品样品经核酸提取、PCR扩增及标记后与芯片上的探针阵列产生互补匹配时，荧光扫描或酶联免疫反应后，依据杂交信号情况，最终定性或定量检测食品样品中的致病菌情况。由于该技术具有大规模、高通量、简单化的特点，在食品安全快检中使用广泛。李君文等建立了分辨率为5.2×107 CFU/ mL的水体中致病性微生物的快速检测方法。Call等通过分析大肠杆菌O157:H7的志贺样毒素Ⅰ和Ⅱ以及溶血素A，得出了基因芯片技术可定性检测各种大肠杆菌O157:H7分离物的结论。由于基因芯片技术还处于科研阶段，还需要不断改进，存在样品制备过程复杂、检测仪器成本高、检测特异性差、有假阳性的情况，以及基因组学资源库相对匮乏、标准化程序建设困难等技术问题亟待解决。

1.3 核酸探针技术

核酸探针技术是根据碱基配对的原理，将目标菌特异基因中的一条链标记成核酸探针，通过检测被检样品与标记的核酸探针能否形成杂交分子，最终判断被检食品样品是否污染该目标致病菌。依据放射性强度定量检测食品中致病菌的量。核酸探针检测致病菌用时较短，且特异性、灵敏度高。

随着核酸探针技术的不断发展进步，其在致病菌检测领域的应用也越来越广泛，另外，新的非放射性基因探针、DNA生物传感器探针、分子信标探针等技术也取得了一定的突破。目前，沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特菌等常见致病菌均可采用该技术进行定性和定量分析。

2 免疫学技术

免疫学应用技术主要有酶联免疫技术、免疫磁珠技术、荧光抗体及乳胶凝集技术等，其基本原理是在反应体系中通过人工标记，借助抗体或抗原在体外发生特异性反应结合后出现的显色、荧等各种现象，从而定性或定量检测被测样品中的微量物质。

金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、致病性大肠杆菌以及单增李斯特氏菌等多种食源致病菌可以通过免疫磁性微球技术进行分析检测。该技术具有精度高、效率高的特点，但是抗体的制备要提前进行，经济性不高。

早期分析植物病毒的酶联免疫技术，目前已被广泛应用在疾病诊断、人体细菌感染判断、动物源食品抗生素残留检测等领域。酶联免疫技术具有灵敏度高和特异性强的特点，由于其抗原、抗体容易受环境因素的影响而发生变化，所以稳定性和重现性不强，对储存和反应环境要求较高，在实际检测应用过程中会有假阳性的情况出现。目前，酶联免疫技术在致病性细菌肠毒素检测中应用较多，对感染伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌和单增李斯特氏菌的食品也能进行快速检测，从而提高了致病菌检验的效率。

乳胶凝集技术作为免疫学技术的一种，其基本原理是乳胶颗粒作为载体，特异性抗体与之结合后，产生凝集反应，根据是否发生凝集反应，从而判断食品是否污染致病菌。目前，在沙门氏菌、葡萄球菌、军团菌、链球菌、李斯特氏菌等致病菌检测方面均有应用。该技术具有准确、快速、简便、经济的优点，但是在环境条件发生改变时，会产生凝集，灵敏度下降。

3 蛋白组学技术

蛋白质组学是生命科学研究领域非常重要的工具，也是定性和定量检测食品中致病菌的理论基础，蛋白质组学是蛋白质谱和基因图谱技术的延伸，蛋白质的分离、鉴定和检测是蛋白质组学的基础。由于每种细菌的飞行时间质谱图都具有特异性，因此，可以利用这一特性通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）进行致病性微生物属种甚至种内的监督，从而弥补以分子生物学为基础检测方法的缺陷，且具有效率高、节省成本且灵敏度高的优点。将来在食品致病菌和腐败菌检测方面具有良好的应用前景。在最近几年，利用蛋白质组学方法鉴定食品中致病菌的报道也在逐年增加。周千渝等建立了蔬菜中出血性大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌基于MALDI-TOF MS法的快速检测方法。

未来，蛋白质组学与基因组学、代谢组学的结合研究会是食品致病菌快速检测的重要方向。

4 生物传感器技术

生物传感器是一种分析目标化合物的装置，由生物识别元件和信号转换元件组成，由传统的物理传感器发展而来。生物传感器具有抗干扰能力强的特点，具有吸收、反射、化学发光、荧光等多种检测模式。生物传感器技术为微生物检验带来了极大的便利，同时，也使食品工业自动在线检测成为可能。Liu Y等人用光学免疫传感器建立了可以在2 h内完成鼠伤寒沙门氏菌快速检测的方法。叶雪梅等研制了可定量检测实际溶液中沙门氏菌浓度的磁致伸缩生物传感器，对其在不同温度条件下的持久性进行了探讨。王一娴以大肠杆菌O157:H7为研究对象，在表面等离子体共振生物传感方法和电化学阻抗谱生物传感法两种生物传感法的基础上，利用新型生物识别分子和纳米材料建立了大肠杆菌O157:H7快速检测方法，同时，还结合仪器分析技术，开发了便携式用于现场大肠杆菌O157:H7快速检测的平台。加拿大魁北克大学光子学研究中心研制出的一种新型传感器可以在15～20 min内定量检测出受污染的水或食物中的致病性大肠杆菌，且该传感器对温度不敏感。

食品中致病菌检测的传感器应用成熟、种类多，出现了很多商品化传感器，但是还存在着检出限低、检测结果准确度不高等问题需要解决。

5 结语

近年来，世界各国对食品安全问题的重视，使食品中致病菌快检技术的需求不断提升。食品中致病菌快检技术也得到了快速的发展，各种各样的快检技术不断出现，成为食品安全检测和监管的有力工具，为食品工业更好更快发展提供了保障。任何一种检测技术都有优缺点，未来微生物学、分子生物学、免疫学、蛋白质组学、生物信息学、分析化学等多学科的互相交叉渗透，研发更灵敏、更搞笑、更实用的食品致病菌检测技术将会是快速检测的发展方向。