猪瘟疫苗中牛病毒性腹泻病毒污染现状及鉴别检测方法研究进展

李 娇，谢金文，王文秀，李 峰，沈志强，

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）和牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）分别是猪瘟（classical swine fever,CSF）和牛病毒性腹泻（Bovine viral diarrhea,BVD）的致病原[1]，其中猪瘟是目前危害我国养猪业健康发展的头号杀手，我国主要采取以疫苗免疫为主的综合防控措施[2]，BVDV除感染牛外还可感染猪、羊、以及野生动物，猪感染BVDV可出现类似于猪瘟的临床症状和病理变化[3]。CSFV与BVDV同属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus），两者的核苷酸序列同源性在60%以上，氨基酸序列同源性在85%以上，存在抗原交叉性和血清学交叉反应[1，4]。猪瘟疫苗在生产过程中要用牛血清、胰酶、牛睾丸等原辅料，原辅料中若带有BVDV抗体将抑制猪瘟病毒的体外培养，降低猪瘟疫苗中病毒含量和疫苗效力，导致猪瘟疫苗质量不合格。原辅料中若带有BVDV抗原将会造成猪瘟疫苗中BVDV外源病毒污染，污染了BVDV的猪瘟疫苗免疫猪群后将对猪瘟疫苗的免疫效果产生干扰作用，BVDV在抑制猪瘟抗体产生的同时，可以刺激猪只产生大量针对BVDV的抗体，而在猪瘟抗体监测时检出的高水平抗体效价中猪瘟保护性抗体较少，大部分可能为BVDV抗体，导致猪瘟疫苗的免疫失败，且BVDV污染的猪瘟疫苗免疫后可使猪群感染BVD，给猪瘟的防控带来极大的安全隐患和不确定因素[5]。笔者就目前我国猪瘟疫苗中BVDV的污染现状及BVDV污染的鉴别诊断方法进行综述，为提高我国猪瘟疫苗质量、保障猪瘟疫苗免疫效果、提升猪瘟综合防控水平提供参考与借鉴。

1 流行现状

鞠厚斌等[6]为调查我国猪瘟疫苗中BVDV的污染情况，采用RT-PCR方法对国内市场销售的6家猪瘟疫苗生产厂家的15份猪瘟活疫苗进行了BVDV的核酸检测，BVDV核酸阳性污染率为26.7%。曹玉美等[7]采用RT-PCR方法对7个猪瘟疫苗生产厂家的兔源猪瘟疫苗和细胞源猪瘟活疫苗共计10批次样品进行了BVDV污染的检测，在兔源猪瘟疫苗中未检测到BVDV，但在8批次细胞源猪瘟疫苗中检出7批次BVDV污染，阳性污染率高达87.5%。陶洁等[8]采用RT-PCR方法对国内相关疫苗厂家2013年生产的10份不同批次猪瘟疫苗进行了BVDV污染的筛查，共检测出阳性样品1份，阳性污染率达10%。叶兆美[9]为了解四川地区规模化猪场所用猪瘟疫苗中BVDV的污染情况，采用RT-PCR方法对10份猪瘟活疫苗进行RT-PCR检测，BVDV污染率为10%。范仲鑫等[10]为了调查湖南省猪瘟细胞苗中BVDV的污染情况，应用RT-PCR方法对湖南省内销售的10个生产厂家48个批次的猪瘟疫苗进行了BVDV的核酸检测，10个生产厂家的猪瘟疫苗中有5个生产厂家检出BVDV核酸阳性，48个批次中有9批次检出BVDV核酸阳性，阳性污染率达18.75%，表明当前湖南省猪瘟疫苗中BVDV污染较严重。张志等[11]采用巢式RT-PCR方法对7份猪瘟疫苗进行BVDV污染的检测，并分析BVDV核酸序列的遗传特性，共检测出3份BVDV阳性样品，阳性污染率达42.86%，分子遗传分析表明污染的BVDV均属于BVDV-1型。祖立闯等[12]应用套式RT-PCR方法对生产猪瘟疫苗的原辅料、半成品以及成品疫苗等51份样品进行BVDV污染的检测，共检出阳性样品22份，阳性率达43.14%，所有阳性样品经测序鉴定均为BVDV-1型。范学政等[13]应用RT-PCR方法对23个批次的猪瘟疫苗进行BVDV污染的检测发现，有5批次疫苗污染BVDV，阳性污染率为21.74%，经测序鉴定均为BVDV-1型。以上病原学调查资料共同表明，BVDV在国内猪瘟疫苗中已具有一定的污染，且在个别地区阳性污染率较高，污染情况比较严峻，这将给猪瘟疫苗的产品质量和猪瘟疫病的综合防控带来极大的安全隐患和不确定因素，应加强重视。

2 鉴别检测方法

目前《中华人民共和国兽药典》（2015年版）中猪瘟疫苗BVDV污染的检测方法为细胞培养法[14]，但该方法检测时间较长、操作较复杂、不适合快速检测，亟待建立可以准确区分BVDV和CSFV的敏感、特异的鉴别诊断方法。由于BVDV和CSFV存在高度的抗原交叉性和血清学交叉反应，对于猪瘟疫苗中BVDV污染的鉴别诊断，主要依靠基于BVDV和CSFV核酸序列差异的分子生物学方法和基于高特异性单克隆抗体的血清学方法。

2.1 细胞培养法

细胞培养法为我国兽药典中推荐使用的方法，该方法通过接种易感细胞、观察病变特征等进行判定。陶洁等[15]对上海某猪场送检的一份疑似BVDV污染的猪瘟疫苗进行了BVDV的分离与鉴定，将猪瘟疫苗样品接种于MDBK细胞，盲传15代后仍无致细胞病变效应，但间接免疫荧光试验表明接种该疫苗后的MDBK细胞能够被BVDV-2型的单克隆抗体BZ-53识别，采用BVDV-1和BVDV-2的5'-UTR的通用检测引物和针对BVDV E2的引物对病毒RNA进行RT-PCR检测，样品能够扩增出约288 bp的BVDV特异性片段，测序分析结果表明分离株属于BVDV-2型，并且其E2基因与牛源XJ-04株（BVDV-2型）的E2基因同源性最高（92.3%），而与猪源ZM-95株（BVDV-1型）E2基因同源性较低（64.5%），表明该猪瘟疫苗中的确污染有1株BVDV-2株。细胞培养法为动物病毒鉴定的经典方法，但该方法存在试验周期长、操作繁琐、检测成本高，且受细胞影响较大、有些非致病变的BVDV毒株无法检测、不适合大批量样品检测等缺点，使之无法成为BVDV污染最有效、便捷的鉴别检测方法。

2.2 分子生物学方法

分子生物学检测方法能够检测到病原体特定的核苷酸序列，可用于猪瘟疫苗中BVDV污染的鉴别诊断。李晶梅等[16]参考GenBank中BVDV和CSFV标准株的基因组序列，选取各自的保守基因区域设计可以进行鉴别检测的特异性引物，经过对PCR反应条件的优化，建立了可以对两种病毒同时检测的双重RT-PCR方法，该检测方法特异性强、敏感性高，可以用于猪瘟疫苗的质量控制，为两种病毒的交叉污染的检测提供一种方便、快捷的方法。祖立闯等[12]根据GenBank公布的BVDV全基因组序列，选择BVDV保守性比较高的5'非编码区，利用Oligo 6.0软件设计了2对特异性引物，建立了检测BVDV的套式RT-PCR方法，该方法检测CSFV、猪繁殖与呼吸综合征病毒、MDBK正常细胞、牛传染性鼻气管炎病毒、猪伪狂犬病病毒均为阴性，该方法第1轮引物的检测灵敏度可达到1 ng RNA，第2轮引物的检测灵敏度可达到0.1 ng RNA。套式RT-PCR方法极大地提高了常规RT-PCR检测方法的特异性和敏感性，重复性好、特异性强、敏感性高，可以准确快速检测出极低含量的BVDV，为动物与疫苗生物制品原辅料中BVDV的快速低含量检测提供了一种简单、特异、敏感、快速的检测方法。葛玉凤等[4]为建立一种快速检测猪瘟疫苗中BVDV污染的方法，根据GenBank上登录的BVDV 5'端非编码区基因组序列设计1对引物，经一步法RT-PCR反应条件的优化，建立了检测猪瘟疫苗中BVDV污染的一步法RT-PCR方法。该方法对CSFV、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、牛副流感病毒3型、牛传染性鼻气管炎病毒的扩增结果均为阴性，对BVDV基因组RNA的检测灵敏度达0.1 ng，与细胞培养法的符合率达100%，应用该方法对猪瘟疫苗、牛血清等138份样品进行BVDV污染的检测，阳性污染率达11.59%。一步法RT-PCR检测方法采用一步法RT-PCR扩增试剂盒，使反转录与PCR扩增一步完成，虽然使用商品化的试剂盒提高了检测成本，但也节省了检测时间，减少了操作步骤，降低了污染概率，同时具有良好的特异性、敏感性、准确性和适用性，可用于猪瘟疫苗生产中血清、细胞、毒种、半成品等的质量控制以及猪瘟疫苗临床应用中的质量检验。

2.3 血清学方法

BVDV和CSFV之间存在高度的血清学交叉反应性，因而难以用普通的血清学方法将BVDV和CSFV区分开。单克隆抗体具有高度的特异性和敏感性，能够识别病毒抗原结构的微小差异，因此，利用BVDV特异性单克隆抗体可以建立区分BVDV和CSFV的血清学诊断方法，进而实现猪瘟疫苗中BVDV污染的鉴别检测。范晴等[17]用兔抗BVDV多抗作为包被抗体，BVDV NS3单克隆抗体作为捕获抗体，建立了检测BVDV抗原的捕获ELISA方法，该方法检测CSFV、牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛分支杆菌均为阴性，其最低可检测7.9×103个TCID50的病毒量，与RT-PCR方法的符合率为100%，所建立的BVDV抗原捕获ELISA方法快速、特异、敏感，可用于BVDV抗原的鉴别检测。

3 小结与展望

我国现阶段猪瘟流行形势复杂，猪瘟防控任务仍十分艰巨，猪瘟疫苗质量将是影响猪瘟综合防控的关键，而现阶段的病原学调查表明我国猪瘟疫苗中存在一定的BVDV污染，必须加强猪瘟疫苗中BVDV污染的严格监测，一方面要加强牛血清等原辅材料的生产与安全管理，从源头上遏制BVDV污染的可能性；另一方面要加强疫苗制备中各个环节的监督管理，提高疫苗制备工艺的安全性和严谨性，逐步提高猪瘟疫苗质量，禁止生产和接种BVDV污染的猪瘟疫苗。在猪瘟疫苗中BVDV污染的鉴别检测方法方面，分子生物学方法弥补了细胞培养法试验周期长、操作复杂以及部分BVDV毒株在细胞上难以产生明显细胞病变等问题，且操作简单、检测快速，一般实验室均可选择使用。基于单克隆抗体的血清学检测方法操作简单、检测快速、高通量，非常适合进行大批量样品检测。相信随着分子生物学和免疫学技术的不断进步，BVDV和CSFV鉴别检测方法的逐步完善，猪瘟疫苗中BVDV污染的鉴别检测方法将逐步提高，猪瘟疫苗中BVDV的污染率将逐步降低，我国猪瘟疫苗质量将不断提高，从而保障我国猪瘟防控事业的稳定发展。