在阴茎勃起中一氧化氮合酶的作用及调节机制研究进展

2018-01-16陈康宁李荣欣综述董治龙审校

中国男科学杂志 2018年2期

高轲陈康宁李荣欣综述董治龙审校

兰州大学第二医院泌尿外科研究所，甘肃省泌尿系统疾病研究重点实验室，甘肃省泌尿系统疾病临床医学中心（兰州 730030）

阴茎勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED）是指阴茎不能达到和（或）维持足够的勃起以获得满意的性生活，并且时间持续3个月以上者[1]，已逐渐成为困扰全球男性的重要疾病之一。近年来，对阴茎勃起的基础研究取得了很大的突破，其中一氧化氮-环鸟苷磷酸（NO/cGMP）通路是目前与阴茎勃起相关最为经典、研究最为深入的分子信号通路，以NO/cGMP通路调控作用为基础的5型磷酸二酯酶（phosphodiesterase type 5，PDE5）抑制剂药物治疗ED已经应用到临床并且取得了很好的疗效。然而，尽管在这一领域的相关研究已经取得了显著的进步，但是充分的认识和理解一氧化氮（nitric oxide，NO）、一氧化氮合酶（NO synthase，NOS）在勃起功能的生理状态和病理状态的作用及相关调节机制仍然具有一定的意义，即在探索这些机制的过程中，发现潜在的治疗靶点，并将之充分的利用到临床，达到治疗的目的，为广大男性ED患者带来更加多元的治疗手段。现将NO及NOS在勃起功能中的作用和相关调节机制做一综述，为进一步的研究阐明理论基础。

一、NO与阴茎勃起

一氧化氮（NO）作为一种短寿命的自由基气体，可以在人体内立即产生，具有高反应性和自由扩散跨细胞膜的特点，因此在人体的的心血管系统，免疫系统和神经系统等各种生物过程中起到了很重要的作用如细胞毒素剂、神经传递素和血管扩张剂[2,3]。勃起功能是一个复杂过程，血管、神经和内分泌之间的相互作用会促进血管的舒张或者降低阴茎海绵体平滑肌细胞的收缩性而导致阴茎的勃起[4]。在阴茎勃起的过程中，NO作为一种主要的气体信使分子，介导了阴茎血管和海绵体平滑肌的松弛，起到了关键性的作用[5]。人体内NO在阴茎中的产生过程与在其他器官中类似，涉及NOS的催化作用。NOS在氧气（O2）和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate，NADPH）存在的条件下催化L-精氨酸（L-arginine）产生 L- 胍氨酸（L-citrulline）和 NO[6]。NO是一种高度亲脂性气体，能够自由通过细胞膜进入到平滑肌细胞内，在细胞内与可溶性鸟苷酸环化酶（soluble guanylyl cyclase，sGC）结合，使后者激活，GTP从而转化为第二信使cGMP，导致细胞内cGMP表达增加，cGMP能够通过相关蛋白的磷酸化、酶、离子通道使海绵体平滑肌和血管舒张，引起勃起发生[7]。相关的报道指出[7,8]，cGMP引起平滑肌舒张的主要机制有两种途径：一种途径是降低钙离子浓度，使钙-钙调蛋白复合体诱导的肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase, MLCK）活性丧失；另一种途径是抑制RhoA活性及在肌球蛋白轻链磷酸酶（myosin light chain phosphatase, MLCP）水平对抗Rho蛋白激酶对MLCP的抑制作用，促进钙脱敏；这两种途径最终都会使肌球蛋白轻链（myosin light chain, MLC）发生磷酸化，从而导致海绵体平滑肌和血管舒张。阴经勃起相关的分子信号通路除了上文所提到的最经典的NO/cGMP通路，还有cAMP通路、CO通路、H2S通路等[9]，这些通路是相互联系，相互作用，共同影响勃起功能。在探索这些小分子信号通路以及这些通路在阴茎勃起的生理状态和病理状态下的相关机制，也许能够发现新方法来治疗威胁男性勃起功能健康状况的相关疾病，并且能为勃起功能障碍的基础研究和临床治疗提供相应的理论依据。

二、NOS调节机制

在共同底物如O2和 NADPH以及辅酶因子如核黄素腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide，FAD），黄素单核苷酸（flavin mononucleotide，FMN），四氢生物喋呤（5,6,7,8-tetrahydroL-biopterin，BH4）等的参与下，NO是由三种异构体的NOS催化L-精氨酸产生的[10]，这三种异构体分别为神经型NOS（nNOS）、内皮型NOS（eNOS）和诱导型NOS（iNOS），其基因分别定位于12、7和17号染色体上；从功能上又可分为组成型（cNOS，包括 nNOS 和 eNOS）及诱导型（iNOS）两种[6]。NOS是由两个相同亚基组成的二聚体，每个NOS亚基有三个不同的结构域：还原酶结构域、钙调蛋白结合结构域和加氧酶结构域，每个结构域具有不同的作用，其亚型主要存在于不同的细胞，具有不同的结构和功能[11]。nNOS主要存在于神经细胞中，在阴茎中分布于盆腔和海绵体神经及其分支上；eNOS主要位于内皮细胞中，在阴茎中分布于动脉、海绵体内皮细胞和平滑肌上，和nNOS具有相似的调节机制即细胞内钙离子浓度升高可以激活这两种亚型；iNOS主要存在于单核细胞中,具有钙依赖性，很少在正常情况下表达，主要作用于免疫系统[4,12,13]。

cNOS锚定在内皮细胞膜的内表面，通过内皮细胞和神经细胞活化，来维持血压和血流量，白细胞-内皮细胞之间的相互作用和神经元间的信号传递等生理环境的稳定[11]，其调节主要是依赖钙离子以及钙与钙调蛋白的结合，其他的一些相关机制有蛋白与蛋白之间的相互作用如热休克蛋白、小窝蛋白、硝基化作用、磷酸化作用和乙酰化作用等[4,14]。例如eNOS的活化就是一个复杂的过程，主要为胞质内钙离子浓度升高与钙调蛋白结合，在热休克蛋白90的参与下，促进eNOS二聚化，并且相关的激酶磷酸酶聚集进一步活化eNOS[15,16]。iNOS主要在一些比如内源性细胞因子、细菌内毒素脂多糖等炎性刺激的作用下产生，从而能够促进NO持续大量产生，具体的作用机制还需深入研究[17]。NOS是促进NO合成的关键酶，弄清楚NOS的调节机制，不仅对于理解NOS调节NO的产生具有重要的意义，而且能够发现影响阴茎勃起的相关因素，为探索阴茎勃起功能障碍的治疗方法提供理论基础。

三、NOS磷酸化的作用

磷酸化和去磷酸化组成了NOS生物活性中的一个主要调节机制。eNOS有多个磷酸化的关键调节位点，丝氨酸1177、635和617号位点，其磷酸化促进酶的活性；而丝氨酸116、苏氨酸495号位点的磷酸化抑制酶的活性[3]。在nNOS的丝氨酸残基中代表关键调节位点的是丝氨酸1412、847、741号，第一个是有促进作用的调节位点，后两个是有抑制作用的调节位点[18,19]。目前已知催化磷酸化的一些特殊蛋白激酶有激酶Akt（蛋白激酶B）、环腺苷酸依赖性蛋白激酶（protein kinase A，PKA）、腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphateactivated protein kinase，AMPK）、环鸟苷酸依赖性蛋白激酶和钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaM激酶Ⅱ）[11,18]。许多不同的胞外刺激物直接激活蛋白激酶，从而导致NOS的激活，例如，血流剪切应力诱发eNOS在丝氨酸1177位点磷酸化是通过PKA，在相同位点，内皮生长因子依赖性磷酸化是通过Akt的调节[11]；谷氨酸的刺激影响nNOS的催化作用，其中，促进作用是通过Akt介导的丝氨酸1412号位点的磷酸化，抑制作用是通过CaM激酶Ⅱ介导的丝氨酸847号位点的磷酸化[18]。使NOS去磷酸化的蛋白磷酸酯酶如丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酯酶1、丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酯酶2A和钙依赖磷酸酶的作用也起到促进或抑制依靠酶特殊功能位点的酶的活性。对NOS的活性上的调节影响，不同激酶和磷酸酯酶的相对贡献和相互作用，我们依然要有充分的认识。

有相关的研究显示，NOS的磷酸化作用在氧化还原信号机制中能促进活性氧类物质的产生而发挥作用[20]。也有报道表明，在大鼠阴茎海绵体组织中，雄激素可以通过上调相关的蛋白，磷酸化eNOS后激活eNOS，促进内源性 NO生成和释放，从而促进大鼠阴茎海绵体的勃起。然而，确切的机制还不清楚[21]。由此可以看出，磷酸化和去磷酸化是NOS活性的调控机制的一个重要组成部分，有助于理解阴茎勃起的生理过程，为临床应用提供新的方法，然而目前相关的机制还不明确，NOS磷酸化和去磷酸化在阴茎勃起与勃起功能障碍的具体作用还需深入的研究。

四、NOS巯基亚硝基化的作用

亚硝基化和去亚硝基化作为一个普遍存在的生物化学机制，构成了NOS酶类活性的一个重要调节机制，其中亚硝基化导致酶类活性抑制，而去亚硝基化增加酶类的活性。亚硝基化作用是一种可逆性的蛋白质巯基氧化修饰方式，通过该方式形成的亚硝基硫醇（S-nitrosothiols）在调控蛋白质的结构、稳定性、细胞定位、蛋白质 - 蛋白质相互作用中具有重要的意义，从而使NO 的生物活性广泛发挥[22]。因此，在NO生物特性的研究中，一个新兴的观点是第二信使亚硝基硫醇在细胞的NO信号转导过程中有重要的调节作用，是NO 发挥广泛生物活性的主要分子机制之一。在亚硝基硫醇功能调节中，关键的酶就是亚硝基谷胱甘肽还原酶，在阴茎的神经和血管中都存在，它能够使亚硝基谷胱甘肽代谢，间接地降低亚硝基化的蛋白质水平，从而可能会影响细胞间的信号传导[23]。巯基亚硝基化（snitrosylation，SNO）作用可以调节NO的多种生物作用如离子通道活性、抗氧化应激、抗凋亡机制、抗炎症反应等，而且有许多因素参与了调节巯基亚硝基化作用，例如α肿瘤坏死因子，氧化的低密度脂蛋白等降低蛋白巯基亚硝基化；剪切应力，严重缺氧增加巯基亚硝基化作用[24]。相关的文献指出，SNO通过抑制可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylyl cyclase)、eNOS本身以及eNOS调节蛋白（热休克蛋白90、Akt等）来负性调节NOS[4]。SNO相关的信号通路发生异常，将会导致细胞功能受损，从而会大大增加疾病的病理生理状态，而且由于NO调节机制的复杂性，对SNO的研究还有很多方面有待深入，如蛋白质的亚硝基化/去亚硝基化/转硝基化的分子反应机制、SNO作用位点选择性、催化机制、调节机制等[25]。

NOS的亚硝基化和去亚硝基化在阴茎生理性勃起中有相关的文献报道，但是其与阴茎勃起的病理状态之间的联系还未确定。NOS亚型与SNO之间关系将会进一步丰富阴茎勃起功能的相关知识，对于揭示多种阴茎勃起功能障碍的特殊机制以及探索新的治疗方法有一定的帮助。

五、总结

毫无疑问，NO在阴茎勃起的生理和病理状态中有着重要的作用，是阴茎勃起的主要媒介物，它在阴茎中有着自我平衡的作用，而NOS作为NO合成的关键酶，涉及了nNOS 和eNOS 在阴茎中各自功能的改变。PDE5抑制剂是以NO信号通路上的一个小分子位点为目标来治疗勃起功能障碍，并且已经取得成功。但在阴茎勃起的生理和病理状态下充分地描述NOS的调节机制仍是必需的，以便能够充分地探讨NO的生物特性而达到临床治疗的目的。总的来说，NOS翻译后的修饰（如磷酸化、S-亚硝基化）是NOS调节中的一个重要的决定性因素，并且相关的研究已经开始探讨在阴茎勃起功能中NOS调节机制的相互关系，为理解勃起功能及勃起功能障碍提供更好的理论基础，也为勃起功能障碍在临床的治疗中提供新的靶点，找到新的方法。

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