液质联用技术在化学药杂质谱研究中的应用

许晓辉，刘建飞，党子龙，赵 波，慕 伟，张生萍

（1兰州市食品药品检验所，甘肃 兰州730050；2中国科学院兰州化学物理研究所，西北特色植物资源化学重点实验室，3兰州大学第一医院药剂科，甘肃兰州730000）

0 引言

液质联用全称为液相色谱⁃质谱联用技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统，被测样品经流动相分离后，进入质谱系统被离子化，经质谱的质量分析器将碎片离子按质量数分开，经检测器得到质谱图。其优势是分析范围广，定性结果可靠，检测限低，分析时间短。液质联用中常用的质谱包括四级杆、三重四级杆、离子阱、四级杆⁃飞行时间质谱、傅里叶变换质谱等。其结合了色谱对复杂样品的高分离能力与质谱的高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点，实现了色谱与质谱的优势互补。液质联用能够推断药物中杂质的结构［1］，确证同分异构体杂质［2］，确认差向异构体杂质［3］，同时能够快速发现药物中的痕量杂质，在化学药杂质研究中被广泛应用。人用药品注册技术要求国际协调会（International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmamceuticals for Human Use，ICH）制定了一些杂质研究指导原则，这些指导原则有《原料药、制剂杂质研究指导原则》、《残留溶剂研究指导原则》、《元素杂质研究指导原则》。《美国药典》、《欧洲药典》、《英国药典》均在附录中设有杂质检查通则，现行版《中国药典》2015年版第四部也收载了《药品杂质分析指导原则》，并且在2005年我国也颁布了《化学药物质量控制方法验证技术指导原则》［4］，这些指导原则对杂质分析及毒理学评价做了宏观上的技术规范［5］。而杂质谱研究强调对杂质研究与控制的全面性、整体性，对各个杂质明确其来源、结构、含量以及生物活性等，根据以上信息制定合理的限度。本文探讨了基于液质联用技术的化学药杂质谱研究，以期为杂质谱研究提供参考。

1 化学药杂质谱控制

化学药品中的杂质与药品的安全息息相关，少数情况下，杂质也与药品效能有关，化学药品的杂质不可能完全消除，但是当杂质达到一定量时便会产生毒副作用，对人体健康造成损害，因此必须在总体水平上对化学药品中的杂质进行确切评价，明确其来源、成分结构、毒副作用及其限量，以保证临床用药安全有效，保障人民生命健康安全。杂质的来源主要包括［6］：药品生产过程中使用的溶剂、催化剂；药物合成过程中反应不完全而遗留的反应原料，初始反应物，合成中间体、合成副产物，合成过程中产生的相关物质；药品贮存、运输过程中的氧化、水解、分解产物；手性化合物中的光学异构体；药物的多晶型；使用的金属工具或不耐酸、不耐碱的器皿引入的重金属及无机盐。化学药品杂质控制是化学药品研发、生产工作的重要组成部分，常见的杂质控制方法分为定性和定量方法。定性方法主要有熔点、TLC、旋光度、HPLC、HPLC⁃MS、NMR 等；定量方法主要有容量法、HPLC、GC、UV、IR、HPCE、HPLC⁃MS 等。 追溯杂质控制理念的变迁，可分为三个阶段：纯度控制阶段、限度控制阶段和杂质谱控制阶段。早期的杂质控制主要依靠化学分析方法，如容量法、分光光度法。后来，随着色谱技术及其他检测技术的发展与应用，色谱技术或者色谱技术与其他技术联用成为化学药杂质控制分析的重要分析方法，同时药品杂质控制是在杂质生物学特性的基础上得到的杂质限量［7］。杂质谱控制是杂质控制的一个总体原则，包括药品中所有杂质的种类、来源、含量及结构等信息，通过杂质谱分析能够较为全面地掌握药品中杂质的种类、来源、含量、结构，根据特定杂质选择合适的分析方法，确保杂质能够有效检出与定量，同时根据杂质安全性试验或临床试验结构评估杂质可接受水平，它强调结合具体工艺与产品特点以及综合药学、药理毒理、临床研究结果对药品中所存在的杂质进行全面地控制，从而保证药品质量的安全性［5］。

2 基于液质联用的化学药杂质谱研究思路

杂质研究是贯穿于药品研发始终的一项重要内容。杂质谱分析是药品质量控制的重要工作。基于杂质谱分析的杂质控制是“质量源于设计”的基本理念在杂质研究与控制中的一种具体实践［8］。应用各国药典及相关的杂质研究技术指导原则在具体杂质谱研究过程中，应充分体现杂质的源头控制、过程控制、终点控制理念，根据药品生产过程中的原料、辅料、工艺等要素，探究药物制剂中可能存在的杂质，并对杂质结构进行确证，根据毒理实验和药品安全进行杂质限度确认［9］。国家药品审评中心（center for drug evaluation，CDE）要求新药、仿制药申报时，必须提供杂质谱研究资料。在通用技术文件（common techni⁃cal document，CTD）中，整体性杂质研究方面，要求申报单位必须包含以下内容：产品中可能存在的杂质及来源；对已知杂质能给出结构并提供结构确证图谱；杂质名称、结构、来源、控制限度以及是否定入质量标准。基于液质联用的化学药杂质谱研究，应不仅能检出样品中已有的杂质，还能有效检出潜在的杂质，并能对杂质进行定性，最终根据不同杂质的来源及生物活性、毒理等方面特性制定相应的质控限度。

2.1 基于杂质研究方面的文献资料调研 杂质前期研究的信息获取主要是文献资料调研，主要的文献资料有美国食品药品监督管理局（The Food and Drug Administration，FDA），欧洲药品管理局（European Medicines Agency，EMA），日本医药品医疗器械综合机构（Pharmaceuticals and Medical Divices Agency，PMDA）公开的资料、专利和文章。一般是从原料药合成路线、主药的理化性质、稳定性影响因素、主药杂质产生的原因及主要的降解产物、处方条件和生产工艺、辅料是否影响主要成分的稳定性等方面进行详细的文献调研，理论的调研为其后的整体性、全面性实践研究提供指导。

2.2 基于合成路线进行工艺杂质的分析 药物在合成过程中，运用起始原料、催化剂反应得到中间体，也可能会产生副产物，由中间体与下一个原料反应，得到第二个中间体，直至得到目标化合物。不同的反应会引入不同的杂质，或者原料在反应过程中反应不完全的起始原料、催化剂、起始原料的降解产物、残留溶剂等，在分离过程中，没有全部分离干净，便会带入到原料药中，而用原料药制备药物制剂时，这些杂质又会被带入药品中。由于这类杂质与药品活性成分有渊源关系，因此也通常称为有关物质，除了降解产物，这些杂质也叫工艺杂质。分析这一类杂质，首先得理解合成反应机理，结合合成路线推测工艺杂质的来源［10］，同时要注意杂质的来源与去向，重点关注可能引入的潜在杂质，由于这类杂质与主成分的结构相似，因此其质谱裂解规律与主成分也有相似之处［11］。

2.3 基于结构特征可能产生的降解产物 一个特定结构的药物，其对应的化学性质行为在一定的外界条件下降解途径是固定的，如稳定性较差或在生产制备过程中容易降解的主药成分，这类杂质通常通过稳定性试验和强降解试验手段来确认杂质，所谓强降解，即将供试品用高温、高湿、强光照射、酸水解、碱水解以及氧化的方法进行破坏，以考察破坏前后杂质变化的基本情况。相对于稳定性试验，强降解试验能够在短时间内获得大量的信息，这类信息主要有降解途径和降解产物，其为药品包装材料和储藏条件提供依据，反过来，也指导药品的生产环节。

2.4 基于处方工艺可能引入的杂质 处方中涉及辅料有助悬剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、着色剂、甜味剂等，在运用原料药和辅料制备药物制剂的过程中，活性成分、辅料在生产过程以及保存条件下的相容性是处方工艺研究的重要内容。如果选择辅料不慎，也可能加速药物的降解致使药物杂质增多而影响用药安全。有时，辅料对于产品质量的影响要比想象的更加严重。另外，某些多晶型的药物，晶型不稳定，在生产过程中，晶型会发生变化，导致药物主成分变质，药效活性降低［12］。

2.5 液质联用分析方法的验证及杂质限度 液质联用定性定量过程中，影响测定方法的不确定度是多方面的［13］。杂质谱分析方法验证的目的是验证所采用的分析方法是否适合相应的定性定量要求。验证项目包括精密度、准确度、检测限、定量限、专属性、线性与范围、耐用性、系统适用性、溶液稳定性。一般用于限度试验的方法验证侧重专属性和检测限，用于定量试验的方法验证强调专属性、准确度和定量限［14］。人用药物注册技术要求ICH对于每日最大剂量≤2 g的原料药，杂质报告限度为 0.05%，鉴定限度为0.10%，控制限度为0.15% ；对每日最大剂量＞2 g的原料药，杂质报告限度为0.03%，鉴定限度为0.05%，控制限度为 0.05%［15］。化学药物制剂质控限度，每日最大剂量≤10 mg，控制限度为1.0%，每日最大剂量介于10～100 mg，控制限度为0.5%，每日最大剂量为100 mg～2 g，控制限度为 0.2%，每日最大剂量＞2 g，控制限度为 0.15%［16］。 如果杂质含量高于ICH的质控限度，必须进行杂质安全性评价；如果杂质含量低于ICH的质控限度，首先进行构效关系研究，如没有遗传毒性警戒结构，符合ICH一般限度就可以，如有遗传毒性结构，则应根据遗传毒性试验的结果确定杂质限度。

3 液质联用在化学药杂质谱研究中的应用进展

近几年，液质联用技术在化学药杂质谱分析中的应用越来越广泛，尤其是在原料药和化学药物制剂杂质谱分析中，对药品中存在的已知杂质进行鉴别，对未知杂质进行结构推导，然后借助光谱、核磁共振等技术手段进行鉴定。如大环内酯类抗生素是临床广泛使用的一类药物，其组分复杂，有关物质种类多且化学性质不稳定，极易产生杂质。王明娟等［17］采用串联质谱法建立了大环内酯类抗生素杂质谱的研究思路，并解析了该类化合物的质谱裂解规律，阐述了基于液质联用分析方法如何依据已知组分的质谱裂解规律推导未知化合物的结构。周长朋等［18］基于高效液相色谱⁃四极杆／线性离子阱质谱仪建立了测定盐酸决奈达隆中两种基因毒性杂质痕量残留的分析方法，该方法利用线性离子阱的高分辨质谱并结合对照首次确证了盐酸决奈达隆中的两种导致基因毒性的杂质，有利于在盐酸决奈达隆合成过程中对该类杂质进行控制。 杨昊等［19］用 HPLC⁃ESI⁃IT⁃MSn 法研究庆大霉素C1a的杂质谱，从庆大霉素C1a原料中检出13种杂质，对其中12种杂质的结构进行了归属，结果显示，庆大霉素C1a中含有庆大霉素A、B、西索米星、小诺霉素、威达米星或其同分异构体和同系物，并含有庆大霉素C1a和上述杂质的降解产物。Zhu等［20］采用LC⁃MS对多索茶碱药物中未知杂质进行研究，推导出其化学结构，并用高分辨率质谱和1D和2D NMR数据证实了该结构。同时，他们还研究了色甘酸钠药物制剂中的相关物质和降解产物，基于质谱光谱数据和准确的质量测量，对2种未知杂质和6种未知降解产物的化学结构进行了表征，其中包括欧洲药典中所列的不纯C。此外，还提出了一种合理的降解产物形成机制［21］。 Kumar等［22］采用高效液相色谱法测定盐酸异丙烯醇的含量，发现了一种未知杂质，通过LC⁃MS分析推导这种未知杂质的化学结构，采用半制备液相从杂质富集的反应粗样品中分离出这种杂质，经核磁共振（1H⁃NMR、13C⁃NMR、DEPT、HSQC）和红外光谱（infrared spectroscopy，IR）确证了该杂质的化学结构。Yang等［23］采用液质方法确证了辅酶A生产过程产生及主药降解物产生的10种杂质，其中7种杂质是首次被发现的，作者对其中3种未知杂质进行了合成，并用NMR进行了鉴定。总之，液质联用是组分复杂样品和微量样品分离分析的有力研究手段，其对样品属性没有限制，样品前处理方法简单，无需化合物有紫外吸收，是化学药杂质研究的主要方法之一［24］。

4 总结

药品中杂质是否得到全面准确的控制直接关系到药品的临床用药安全性。杂质谱分析强调杂质控制的系统性和整体性，通过杂质谱分析可以全面掌握杂质的种类、结构、来源和限量。杂质谱分析遵循“质量源于设计”，从杂质的来源入手，从合成路线工艺、化学结构、处方工艺等方面进行分析，探究药物中可能存在的副产物、降解物、中间体、溶剂残留、催化剂残留等。杂质分析方法验证应具有针对性和全面性，保证建立的方法能够全面检出潜在的杂质，防止出现杂质漏检的情况。在应用液质联用技术进行杂质谱研究时，不仅要根据目标化合物的分子量、基质、结构等优化质谱条件，更重要的是有丰富的质谱解析知识和经验，能够根据杂质的裂解情况、特征离子推断杂质结构，并结合其他检测方法对杂质进行鉴定。

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