板栗多糖的提取、分离纯化方法及其生物活性

宋磊肖，何俊平，贾晓韩，范得跃，李晓菁

(河北科技师范学院，河北秦皇岛 066600)

板栗(CastaneamollissimaBlume)为壳斗科栗属植物，原产于中国，素称“铁杆庄稼，木本粮食”，国外称之为“健康食品”。板栗具有很高的营养价值，富含多糖、淀粉、蛋白质、维生素、脂肪及矿物质元素，可供人体吸收和利用的养分高达98%[1]，且具有药用价值[2], 是一种营养保健品。中医学认为，板栗性味甘温，有养胃健脾、补肾强筋、活血、止血消肿，益于高血压、冠心病的防治等功能[3]。近年来，板栗研究多集中于糖的提取、分离纯化[4]，对多糖活性和结构的研究少。笔者对板栗多糖的提取、分离纯化、结构研究中应用的方法和已研究发现的板栗多糖的功能进行了综述。

1 板栗多糖的提取方法

板栗多糖的提取方法有水提取法、酸提取法、碱提取法、酶辅助法、微波提取法、超声波提取法、亚临界水提取法、加压溶剂萃取法等。

1.1 水提取法

水提取法是板栗多糖提取的传统方法，分为热水提取法和冷水提取法。因冷水提取法得到的仅是存在于细胞壁之外的一些易溶于水的多糖类物质，故常采用热水提取法，一般将温度控制在60～90℃。如李润丰等人对河北省迁西县大板红多糖采用热水提取法，最适条件为提取温度60℃，时间1.5小时，料液比1∶20，多糖得率9.85%[5]；梁雪采用提取温度65℃，提取时间1小时，液料比1∶35，提取燕龙板栗中的多糖，其得率16.94%[6]；戴成国利用热水提取法和正交试验法确定了提取板栗多糖的最佳条件为浸提温度85℃，浸提时间3小时，浸提次数3次，料液比1∶30，多糖得率12.64 %[7]。张美等人采用热水提取法正交试验设计提取湖北荆山板栗中的多糖，提取最适温度为90℃，时间150分钟，料液比1∶30，多糖得率6.24%[8]。

1.2 酸提取法

酸提取法是用适宜的乙酸或盐酸将含葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖提取出来的方法[9]。

王晓红[10]、梁雪[6,11]和周艳[12]采用酸提取法提取燕山板栗中的多糖，其中王晓红和周艳通过正交试验法确定了提取多糖的最佳条件为盐酸浓度0.72mol/L，提取时间40分钟，提取温度70℃，料液比1∶20，多糖得率18.66%。

1.3 碱提取法

碱提取法是利用稀碱溶液对多糖进行提取的方法。其原理是稀碱液有助于解除植物细胞壁分子间的化学和物理作用，并可转化多糖与蛋白质间的结合方式[13,14]。张泽俊等人采用碱提取法提取了昭通市售板栗中的多糖，在固定料液比(1∶40)和原料料径(80目筛)的基础上，通过单因素试验法优化了其提取条件：提取浓度0.5mol/L，提取时间90分钟，提取温度80℃，多糖提取率26.47%[15]。

1.4 酶辅助法

酶辅助法是利用酶反应的高度专一性将植物细胞壁降解，使得多糖被释放而被提取的一种方法[9,14,16]。张美利用酶辅助提取法和正交试验法得出板栗多糖提取的最佳条件：提取温度45℃，提取时间240分钟，提取料液比1∶18，多糖提取率7.36%[8]。李悦采用酶提取法提取板栗中的多糖，并通过单因素试验和正交试验法确定提取多糖的最佳工艺条件：提取温度50℃，提取液pH值5.5，提取时间6小时，酶添加量3%，多糖提取率12.11%[17]。

1.5 微波提取法

微波提取法是根据微波在传输过程中遇到不同性质的物质时，会在微波的反射、穿透和吸收上产生差异，进而选择性地使细胞内的极性分子的温度升高，细胞内压增大，最终使细胞内的有效成分自动流出，利用了微波穿透能力强和加热迅速的特点。王晓红[10]和周艳[12]采用微波提取法和正交试验提取燕龙板栗中的多糖，得最佳条件：微波功率800W，提取时间50秒，提取剂用量30mL/g，提取率11.87%；张美利用正交试验得出微波提取板栗多糖的最佳条件：微波功率600W，微波处理时间5分钟，提取时间80分钟，提取率9.34%[8]。

1.6 超声波提取法(超声波辅助提取法)

超声波提取法是通过超声波的空化效应和强烈震动，破碎原料细胞壁，促进多糖的溶出，提高多糖得率的一种方法[9,15,16,18,19]。杨芳等用超声波提取板栗中的多糖，在单因素试验基础上运用正交试验法确定了提取多糖的最佳工艺条件：超声波功率100W，超声处理时间35分钟，水浴提取时间60分钟，多糖提取率13.94 %[20]；伍小红等人用此法提取板栗多糖，通过正交试验法得：超声波功率200W，超声处理时间24分钟，提取温度80℃，提取时间2.5小时，料液比1∶25(g/ml)，多糖得率14.20%[21]；李润丰等用超声波法提取多糖，其优化的提取条件为超声波功率160W，提取时间45分钟，提取温度65℃，料液比1∶35，多糖得率10.34%[5]。

1.7 亚临界水萃取法

亚临界水萃取法是在一定的压力下，将水加热到100～374℃时，水仍然保持液体状态，与常温常压水相比更近似于有机溶剂，水的极性在较大范围内变化，可实现天然产物中有效成分从水溶性成分到脂溶性成分的连续提取[22,23]。邵亭亭等人利用此法提取板栗多糖，通过正交试验确定了提取板栗多糖的优化条件：提取压力5.0MPa，提取温度150℃，提取时间10分钟，料液比1∶20(g/ml)，多糖提取率14.89%[24]。

1.8 加压溶剂萃取法

加压溶剂萃取法是在较高温度(50～200℃)和压力(1000～3000Pa)下，用有机溶剂萃取固体或半固体的自动化方法。梁雪等人采用加压溶剂萃取法提取燕龙板栗中的多糖，通过正交试验确定了提取板栗多糖的优化条件：萃取压力6MPa，静态萃取时间8分钟，萃取温度70℃，循环2次，多糖提取率20.14%[11]。

除以上方法之外，多糖的提取方法还有超临界萃取法[15,16,19]、超高压提取法[16]、超滤法[19]、氨水浸泡法[25]、微波-超声波辅助提取法、缓冻协同微波辅助提取法、超声-酶辅助提取法[9]等，但这些方法在板栗多糖的提取中未见报道。

2 板栗多糖分离纯化

在板栗多糖提取、分离纯化、含量测定、结构分析及活性测定中，分离纯化是最关键的一步，关系到其后对多糖的结构分析及活性研究[26]。

2.1 板栗多糖的分离

2.1.1 脱蛋白 Sevage法[16,18,26-28][Sevage试剂是氯仿∶正丁醇(体积比)=4∶1混合而成]是最常用的脱蛋白的方法，其原理是利用蛋白质在三氯乙烷等有机溶剂中变性的特点。板栗多糖脱蛋白的操作方法是将提取液与Sevage试剂按体积1∶1混合，剧烈振荡，静置，分层，除去中间层变性蛋白，多次重复直至无中间层出现[6,10-12]。这种方法的优点是条件温和，不会引起多糖的变性。三氯乙酸法(TCA)是以三氯乙酸做有机溶剂，使样品中的蛋白质因有机酸的作用而变性沉淀。杨利剑应用此法去除板栗多糖中的蛋白质，但未明确用量[29]。在板栗多糖脱蛋白中还未应用到的脱蛋白方法有三氯乙酸-正丁醇法、三氯三氟乙烷与Sevage联用法、氯仿-正丁醇-甲醇-乙醇-氯化钠法、等电沉淀法、酶解法、综合法(酶-三氯乙酸-正丁醇法、酶-三氯醋酸、酶-Sevage法)、径向色谱新技术等[16,27,28]。

2.1.2 脱色素 多糖脱色法有活性炭法、双氧水法[28]和大孔树脂法[9,16,26]。在板栗多糖脱色中常采用大孔树脂脱色法，其原理是以大孔树脂为吸附剂，利用其对不同成分的选择性吸附和筛选作用，通过选用适宜的吸附和解吸条件，分离、提纯某一种或某一类有机化合物的技术[29,30]。

2.2 板栗多糖的纯化

多糖纯化的方法多，如层析法(按层析过程的机理分吸附层析法、分配层析法、离子交换层析法、凝胶层析法、亲和层析法等；按操作形式分柱层析法、纸层析法和薄层层析法等)、沉淀法(季铵盐沉淀法、分级沉淀法)、透析法、金属络合物法等[31-34]。

李清宇采用柱层析法对所得板栗多糖粗品进行了分离纯化，DEAE-52纤维素柱层析结果表明，用0.1mol/L NaCl洗脱得到板栗多糖CPS1，用0.2mol/LNaCl洗脱得到板栗多糖CPS2[4]。戴成国对其试验所得的粗多糖采用季铵盐沉淀法分离纯化得到酸性多糖CP-1、中性多糖CP-2及碱性多糖CP-3[7]。何玲玲采用80%乙醇沉淀法从板栗中提取到板栗多糖CPS，再经DEAE-纤维素柱层析分离纯化得到纯化多糖组分CPS1[33]。

3 生物活性

研究发现，多糖具有抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳、抗凝血、降血脂、降血糖、抗菌消炎、抗辐射、防止心血管疾病等功能[35-45]，被广泛应用于功能性食品、保健品和临床上。作为药食两用的板栗，对其多糖活性的研究现已成为国内外研究的热点之一。

3.1 抗氧化性

何玲玲分析了从辽宁省丹东市宽甸满族自治县板栗中提取的多糖，发现CPS对羟基自由基、超氧阴离子自由基、过氧化氢的清除作用及还原能力均强于纯化后的CPS1[33]。邵亭亭发现在板栗多糖相同浓度下，亚临界水萃取的板栗多糖对羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除能力优于热水提取法的[27]。李润丰以维生素C(Vc)为对照，对比分析发现，迁西板栗多糖在相同浓度下，其还原能力、清除羟基自由基和亚硝酸根离子及抗卵磷脂脂质体氧化能力均低于Vc[46]。戴成国对镇安1号板栗中的多糖进行活性研究，发现其具有还原能力和清除羟基自由基、超氧阴离子自由基的能力，但都弱于Vc[7]。

3.2 提高白细胞、抗凝血

杨利剑研究发现，湖北罗田板栗多糖明显升高昆明种小白鼠白细胞，延长小白鼠凝血时间[29]。聂牧对板栗多糖进行抗动脉血栓形成研究，发现板栗多糖(200、300 mg/kg)可延长小鼠的出血时间(剪断尾尖开始至血流停止的时间)、凝血时间(从采血开始至挑起血丝的时间)及血栓形成时间(从取下滤纸条至颈总动脉血流量降至并稳定在120PU下保持1分钟的时间)，降低血流波动性，表明板栗多糖抗动脉血栓机制与其抗血小板和抗凝血有关[47]。

3.3 抗肿瘤

梁雪采用体外MTT试验法对从燕龙板栗中提取纯化的多糖进行了抗肿瘤研究，发现板栗多糖对人肝癌细胞 Bel-7402、子宫癌细胞HCT-8和肺癌细胞 A-549都有明显的抑制增殖作用，其中对人肝癌细胞 Bel-7402的生长抑制作用最为明显。当板栗多糖浓度为300μg/mL时，对上述3种人癌细胞的生长抑制率分别为69.54%、55.27%和51.38%，并对剂量有依赖性[6]。李红艳等对板栗多糖及硒酸化修饰后的板栗多糖进行活性测试，结果为多糖CP0-1和sCP0-1在体外均可诱导宫颈癌HeLa细胞发生凋亡；硒酸化修饰后多糖对肿瘤细胞的抑制作用明显增强[46,48]。

3.4 抗疲劳

李清宇对购于陕西镇安县板栗中的多糖进行抗疲劳活性研究，结果显示，低剂量、中剂量和高剂量的板栗多糖均降低了运动后小鼠体内血乳酸和血尿素氮的含量，提高了肌糖原和肝糖原的含量，且显著提高了小鼠的运动耐力，其中以中剂量200mg/(kgod)效果最佳[4]。

4 展望

活性多糖具有抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳、抗凝血和提高白细胞等生物活性。板栗是药食两用的果实，主要成分是多糖和淀粉。最新数据显示，中国板栗总面积达到180万hm2，年产板栗195万t，占世界板栗总产量的84%[49]。加大对板栗深加工的研究，尤其加大对板栗多糖化学结构和生物活性的研究，可推进板栗由单一的食品功能向保健品和医药用品等功能延伸,满足市场对天然物品的需求，提高人民的身体素质、增进健康；增加板栗的附加值，推动中国板栗资源的利用和发展。