CD4+CD25+调节性T细胞与神经系统自身免疫性疾病研究进展

阳玉洁 卢祖能 王云甫

人体免疫系统能够识别和清除外来入侵的抗原，使人体免于病毒、细菌、污染物质的攻击，还能识别和清除体内发生突变的肿瘤细胞、衰老细胞、死亡细胞或其他有害成分，而不攻击人体的正常组分，免疫系统的这种识别“自己”、排除“非己”的功能使免疫系统处于一个稳定的、动态平衡的状态。当这种平衡被打破时，免疫系统就会与自身的正常组分发生反应，导致自身免疫性疾病的发生。调节性T细胞(Treg)是具有免疫抑制功能的CD4+效应T细胞亚群，1995年Sakaguchi等[1]研究发现成年鼠外周血中近10%的CD4+T细胞表达白介素(interleukin，IL )-2受体α链CD25，去除该群细胞会引起小鼠自发产生多种自身免疫性疾病，而回输该细胞则可阻止疾病的发生、进展，因此将该群细胞命名为CD4+CD25+Treg。Treg细胞能够抑制自身反应性T细胞和自身反应性B细胞的活化，是维持免疫平衡和自身免疫耐受的关键细胞。大量研究表明，重症肌无力(MG)[2]、吉兰-巴雷综合征(GBS)[3]、多发性硬化(MS)[4]等多种神经系统自身免疫性疾病的发生均与Treg细胞的数量减少或功能紊乱有关。现就CD4+CD25+Treg在神经系统自身免疫性疾病发病中的作用机制研究进展进行综述，为自身免疫性疾病的治疗探寻新的途径。

1 Treg细胞的表面标记和分型

根据Treg细胞诱导和分化的起源，可将其分为天然产生的自然调节性T细胞(nTreg)和诱导产生的适应性调节性T细胞(iTreg)，另外尚包括CD8+Treg、自然杀伤性(nature kill，NK)T细胞、CD4-CD25-Treg等。nTreg在胸腺中发育，后分化迁移到外周，故又称胸腺衍生的Treg，其表型为CD4+CD25+Foxp3+，约占外周血CD4+T细胞的5%～10%；iTreg在外周血由初始CD4+T细胞经抗原诱导产生，故又称外周诱导的Treg，如Tr1(CD4+CD25lowFoxp3-)、Th3(CD4+CD25-Foxp3-)，主要发挥负性免疫调节作用。人体内的CD8+Treg主要来源于CD8+CD28+T淋巴细胞，而NKT细胞是一群独特的αβT细胞，除表达T细胞受体TCRαβ外，还表达NK细胞的受体NK1.1或NK161[5]。基于CD45RA的表达，新的Tregs亚群已被鉴定。CD45RA不同的表达实现了对不同的Tregs亚型进行识别和分离，这些Tregs亚型具有不同的抑制功能和扩增能力，包括静息性Tregs(CD4+CD45RA+Foxp3low)、活跃性Tregs(CD4+CD45RA-Foxp3high)和分泌细胞因子的Tregs(CD4+CD45RA-Foxp3low)[6]。Helios是Ikaros转录因子家族中的一员，是一个可用于Tregs亚群区分的候选者，Helios+Foxp3+CD4+Tregs的比例越高，Tregs的免疫抑制功能越强[7]。CD4+CD25+Foxp3+作为Treg细胞的一种特殊亚型，近年来受到极大的关注。Foxp3是叉状头转录因子家族中的一员，是Treg细胞具特异性的标记物，为Treg细胞发育成熟以及实现生物学功能的必需分子，除了Foxp3，Treg细胞的转录因子还有samd3和stat5。利用流式细胞技术检测Foxp3可以鉴定人外周血CD4+CD25+Treg细胞，但Foxp3是一种细胞内的核抗原，需要对细胞固定和破膜进行胞内染色，由于个体差异性的存在，不同血样本的CD4+T细胞破膜时间不同，故操作起来烦琐且比较困难，且分选的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞不能用于后续的实验。CD127为IL-7受体α链，有研究表明，在低表达CD127的CD4+T细胞亚群中，超过90%者表达Foxp3，即CD127的表达与Foxp3的表达呈负相关[8]，而CD49d，即整合素VLA-4(α4β1)的α链则表达于大多数促炎性效应细胞[9]。去除 CD4+CD25+细胞群内的CD127high细胞可富集高水平Foxp3表达以及具有高扩增潜能的Tregs亚型；而如果使用抗CD127和抗CD49d的抗体组合，则提供了一种以负选(如：去除)的方式分离具有抑制作用的高纯度、未经标记的Tregs。故可用CD127作为Treg细胞特异性的表面标记分子，相比Foxp3，CD127位于细胞表面，在流式染色检测方面具有更大的优势。其他的标记分子如细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、糖皮质激素诱导肿瘤坏死因子受体(GITR)、程序性死亡蛋白1(PD1)、CD45RO均表达于Treg细胞，并且在Treg细胞的免疫抑制和免疫耐受中发挥重要作用，但这些标记物在效应T细胞中也有表达，不能作为Treg细胞的特异性标记分子[5]。

2 Treg的作用机制

2.1通过细胞间的接触性机制分泌IL-10的Tr1细胞能够表达可诱导共刺激分子(inducible costimulator ，ICOS)和PD1，从而发挥免疫抑制作用，但ICOS和PD1并不是其特异性表面标记物。淋巴细胞活化基因3也表达于分泌IL-10的CD4+T细胞表面，能以高亲和力与主要组织相容性复合体Ⅱ类分子(MHC-Ⅱ)结合，从而抑制树突状细胞(dendritic cell，DC)的活化，负向调控T细胞功能[10]。CTLA-4高表达于Treg表面，能够下调DC上CD80和CD86的表达，使活化的T细胞数量减少[11]。Tregs通过其表面分子与抗原提呈细胞(antigen presenting cell ，APC)表面的共刺激分子接触结合而激活，减弱共刺激信号及抑制抗原递呈作用等对APC进行负向调节，从而发挥其免疫抑制功能。

2.2通过抑制性细胞因子在有抗原刺激时，转化生长因子-β(TGF-β)不仅能够诱导Foxp3的表达，还能使CD4+T细胞向Treg转变，而IL-10作为目前公认的免疫抑制因子，其对APC(抑制细胞因子产生和抗原递呈)和T细胞(抑制细胞因子产生和增殖)精确的免疫抑制分子机制仍然有争议。IL-10 具有双重角色，一方面它具有保留Foxp3在Tregs上高表达的作用，另一方面它又能高效地促使 B 细胞增殖、分化从而在MG的发病中扮演一个致病的角色。Tregs除了分泌IL-10、TGF-β等免疫抑制因子，还高表达IL-2受体，Tregs的IL-2受体能够竞争性结合IL-2，从而阻断IL-2对其他T细胞的刺激增殖作用，且IL-2还能上调Tregs Foxp3的表达[12]。糖蛋白A为主的重复序列(glycoprotein Arepetitions predominant，GARP)是一种富含亮氨酸重复序列的跨膜蛋白，GARP选择性表达于活化的nTregs表面，能够诱导潜在的TGF-β转化为活化的TGF-β，在nTregs的免疫抑制中发挥作用[13]。

2.3分泌可溶性抑制因子穿孔素又称溶细胞素，其功能是在靶细胞膜上形成多聚穿孔素管状通道，导致靶细胞溶解破坏。穿孔素在Tregs介导的免疫抑制中发挥重要作用，在抗肿瘤免疫中，Foxp3+T细胞通过穿孔素依赖机制限制DC存活，其中也涉及到Foxp3+T细胞和肿瘤抗原提呈细胞的直接接触[14]。除了穿孔素外，CD18和颗粒酶也可通过对靶细胞的细胞毒作用而发挥免疫抑制效应。

通过上述机制，Tregs不仅能负性调控CD4+和CD8+T细胞，还能抑制其他免疫细胞如B细胞、NK细胞、DC细胞和其他APC发挥免疫功能。

3 Treg细胞与自身免疫性疾病

3.1Tregs与MGMG是一种主要由抗乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor，AChR)抗体介导、细胞免疫依赖、补体参与，累及神经-肌肉接头突触后膜，导致神经-肌肉接头传递障碍而引起骨骼肌收缩无力的获得性自身免疫性疾病[15]。 目前认为，神经-肌肉接头处突触后膜AChR自身致敏和破坏是MG发病的主要环节，胸腺中存在大量激活的自身反应性CD4+T细胞，特别是AChR反应性CD4+T细胞是MG发生的重要原因[16]。研究发现，与健康对照组相比，MG患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg细胞Foxp3的 mRNA 和蛋白表达均下降，且这些细胞对AChR激活的CD4+CD25-T细胞的增殖抑制能力明显减弱[2]。 Xu等[17]研究发现MG患者外周血CD4+CD25+Treg的比例与疾病的状态有关，病情控制稳定的MG患者Treg比例接近正常，而病情未能得到很好控制的患者外周血Treg细胞比例明显降低，且Foxp3表达下降。Wang等[18]以MG 患者CD4+CD25+Treg细胞线粒体自噬状态与其功能的相关性研究为切入点，利用透射电镜、共聚焦显微镜等观察自噬发生的各个阶段，发现MG患者CD4+CD25+Treg细胞存在线粒体自噬的异常，且MG患者Treg细胞的增殖抑制能力与对照组相比明显减弱。这可能是由于Treg细胞线粒体自噬减弱，引起活性氧和线粒体毒性物质大量堆积，引发细胞功能障碍，导致自身反应性T、B细胞的异常激活而导致，这对探讨MG的发病机制提供了新方向，但确切机制有待于进一步研究。

3.2Tregs与GBSGBS是一种急性或亚急性起病，以周围神经和神经根的脱髓鞘病变及小血管炎性细胞浸润为病理特点的自身免疫性疾病，该病由细胞免疫和体液免疫介导，分子模拟机制是目前认为可能导致GBS的最主要机制之一[19]。 研究表明，GBS患者外周血CD4+CD25+CD127-/CD4+T细胞的比例明显下降，但其经典型与变异型相比，外周血CD4+CD25+CD127-/CD4+T细胞比例无统计学差异[20]。Chi等[21]研究发现，经过丙种球蛋白或血浆置换治疗后稳定期的GBS患者外周血Tregs数量较急性期升高，且Foxp3的表达、Tregs的免疫抑制功能与正常对照者无统计学差异，这可能是GBS呈单相自限性病程的原因。利用干扰素γ(interferon γ，IFN-γ)处理GBS患者的CD4+CD25-T细胞可以诱导其向iTregs转变，在GBS和实验性自身免疫性神经炎(EAN)的发病机制中，IFN-γ被认为可能起着免疫调节的作用[22]。EAN是GBS的动物模型，用阿托伐他汀处理EAN小鼠后发现，阿托伐他汀可通过抑制Th1/Th17的免疫效应、下调共刺激分子的表达、增加CD4+CD25+Foxp3+T细胞数量等途径来改善EAN的临床症状[23]。

3.3Tregs与MSMS是由致病性T细胞针对髓鞘抗原所引起的以中枢神经系统白质脱髓鞘病变为特点的一种自身免疫性疾病，T细胞的过度活化与Tregs的局部调节机制紊乱相关[24]。目前，实验性自身免疫性脊髓炎(EAE)是研究MS公认的动物模型。Beeston等[25]研究发现，穿孔素缺乏型的C57/BL6小鼠其慢性复发性EAE的病程更严重，肿瘤坏死因子家族中的Fas/FasL在Tregs介导的保护EAE机制中无明显作用，而IFN-γ在该机制中发挥着重要作用。Noori-Zadeh等[26]对MS患者和正常对照者外周血CD4+CD25+Tregs的数量进行了系统评价，该评价最终纳入了8项随机对照研究，研究结果发现MS的发病与外周血CD4+CD25+Tregs的数量减少无关，可能与Tregs的功能障碍相关。IFN-β可通过上调DC上GITR配体基因的表达，从而诱导CD4+CD25+Foxp3+Treg增殖，达到治疗MS的目的[27]。La 等[28]研究发现，与健康对照组相比，复发-缓解型MS患者Tregs的糖酵解水平和有氧氧化水平明显降低，而经TGFβ-1a治疗可明显升高MS患者的Tregs代谢水平。白血病抑制因子是IL-6家族中的一员，被认为是一种新型的治疗MS的候选药物。Janssens等[29]研究发现，白血病抑制因子能够有效地增加MS患者CD4+T细胞中Tregs的比例。由上述可知，MS的发病与Tregs密切相关。

综上所述，Treg细胞作为一类具有免疫抑制效应的T淋巴细胞亚群，在预防自身免疫、维持免疫系统的稳态和对自身抗原耐受等方面具有重要的作用。利用Tregs的免疫抑制作用达到治疗目的是研究人员非常感兴趣的领域，其在治疗自身免疫性疾病、预防移植排斥反应和肿瘤免疫治疗方面具有巨大潜力。目前关于Tregs的基础研究及其与自身免疫性疾病的相关性研究已广泛展开，除了MG、GBS及MS外，1型糖尿病、自身免疫性甲状腺疾病、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮及炎性肠病等多种自身免疫性疾病均与Tregs的功能障碍相关，对于这些问题的探索有助于进一步明确CD4+CD25+Treg细胞参与自身免疫性疾病发病的机制，从而为今后的临床治疗提供更多的思路，但在如何选择功能稳定的Treg细胞、Treg的扩增技术以及安全应用等方面仍然存在问题，有待于进一步研究。

[1]Sakaguchi S，Sakaguchi N，Asano M，et al. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains(CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases[J]. J Immunol，1995，155(3)：1151-1164.

[2]Thiruppathi M，Rowin J，Ganesh B，et al. Impaired regulatory function in circulating CD4(+)CD25(high)CD127(low/-)T cells in patients with myasthenia gravis[J]. Clin Immunol，2012，145(3)：209-223.

[3]Harness J，McCombe PA. Increased levels of activated T-cells and reduced levels of CD4/CD25+cells in peripheral blood of Guillain-Barre syndrome patients compared to controls[J].J Clin Neurosci，2008，15(9)：1031-1035.

[4]Mohiuddin IH，Pillai V，Baughman EJ，et al. Induction of regulatory T-cells from memory T-cells is perturbed during acute exacerbation of multiple sclerosis[J]. Clin Immunol，2016，166-167：12-18.

[5]Qiao Y C，Pan Y H，Ling W，et al. The Yin and Yang of regulatory T cell and therapy progress in autoimmune disease[J]. Autoimmun Rev，2017，16(10)：1058-1070.

[6]Li Z，Ping Y，Yu Z，et al. Dynamic changes in CD45RA(-)Foxp3(high) regulatory T-cells in chronic hepatitis C patients during antiviral therapy[J].Int J Infect Dis，2016，45：5-12.

[7]Li X，Li D，Huang X，et al. Helios expression in regulatory T cells promotes immunosuppression，angiogenesis and the growth of leukemia cells in pediatric acute lymphoblastic leukemia[J]. Leuk Res，2018，67：60-66.

[8]Hartigan-O’Connor DJ，Poon C，Sinclair E，et al. Human CD4+regulatory T cells express lower levels of the IL-7 receptor alpha chain(CD127)，allowing consistent identification and sorting of live cells[J]. J Immunol Methods，2007，319(1)：41-52.

[9]Kleinewietfeld M，Starke M，Di Mitri D，et al. CD49d provides access to “untouched” human Foxp3+Treg free of contaminating effector cells[J]. Blood，2009，113(4)：827-836.

[10]Gagliani N，Magnani C F，Huber S，et al. Coexpression of CD49b and LAG-3 identifies human and mouse T regulatory type 1 cells[J]. Nat Med，2013，19(6)：739-746.

[11]KaliaV，Penny LA，Yuzefpolskiy Y，et al. Quiescence of memory CD8+，T cells is mediated by regulatory T cells through inhibitory receptor CTLA-4[J]. Immunity，2015，42(6)：1116-1129.

[12]Wang YM，Ghali J，Zhang GY，et al. Development and function of Foxp3+regulatory T cells[J]. Nephrology(Carlton)，2016，21(2)：81-85.

[13]Zhang M，Robinson TO，Duverger A，et al. Regulatory CD4 T cells inhibit HIV-1 expression of other CD4 T cell subsets via interactions with cell surface regulatory proteins[J]. Virology，2018，516：21-29.

[14]Boissonnas A，Scholerdahirel A，Simonblancal V，et al. Foxp3+T cells induce perforin-dependent dendritic cell death in tumor-draining lymph nodes.[J]. Immunity，2010，32(2)：266-278.

[15]Sanders DB，Wolfe GI，Michael B，et al. International consensus guidance for management of myasthenia gravis：Executive summary[J]. Neurology，2016，87(4)：419-425.

[16]Melms A，Schalke BC，Kirchner T，et al. Thymus in myasthenia gravis. Isolation of T-lymphocyte lines specific for the nicotinic acetylcholine receptor from thymuses of myasthenic patients[J]. J Clin Invest，1988，81(3)：902-908.

[17]Xu WH，Zhang AM，Ren MS，et al. Changes of Treg-associated molecules on CD4+CD25+Treg cells in myasthenia gravis and effects of immunosuppressants[J]. J Clin Immunol，2012，32(5)：975-983.

[18]Wang N，Zou L，Yuan J，et al. The abnormal mitophagy of regulatory T cells in peripheral blood of patients with myasthenia gravis[J]. Chin J Neuroimmunol Neurol，2017，24(4)：270-275.

[19]Willison HJ，Jacobs BC，van Doorn PA. Guillain-Barré syndrome[J].Lancet，2016，388(10045)：717-727.

[20]王浩. 调节性T细胞CD4+CD25+CD127-在吉兰-巴雷综合征患者不同表现型外周血中的表达及意义[D]. 蚌埠医学院，2015.16-19.

[21]Chi LJ，Wang HB，Zhang Y，et al. Abnormality of circulating CD4(+)CD25(+) regulatory T cell in patients with Guillain-Barré syndrome[J]. J Neuroimmunol，2007，192(1-2)：206-214.

[22]Huang S，Li L，Liang S，et al. Conversion of peripheral CD4+CD25-T cells to CD4+CD25+regulatory T cells by IFN-γ in patients with Guillain-Barré syndrome[J]. J Neuroimmunol，2009，217(1-2)：80-84.

[23]Xu H，Li XL，Yue LT，et al. Therapeutic potential of atorvastatin-modified dendritic cells in experimental autoimmune neuritis by decreased Th1/Th17 cytokines and up-regulated T regulatory cells and NKR-P1(+)cells[J]. J Neuroimmunol，2014，269(1-2)：28-37.

[24]Costantino CM，Baecherallan C，Hafler DA. Multiple sclerosis and regulatory T cells[J]. J Clin Immunol，2008，28(6)：697-706.

[25]Beeston T，Smith TR，Maricic I，et al. Involvement of IFN-γ and Perforin，but not Fas/FasL interactions in regulatory T cell-mediated suppression of experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. J Neuroimmunol，2010，229(1)：91-97.

[26]Noori-Zadeh A，Mesbah-Namin SA，Bistoon-Beigloo S，et al. Regulatory T cell number in multiple sclerosis patients：A meta-analysis[J]. Mult Scler Relat Disord，2016，5：73-76.

[27]Chen M，Chen G，Deng S，et al. IFN-β induces the proliferation of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells through upregulation of GITRL on dendritic cells in the treatment of multiple sclerosis[J]. J Neuroimmunol，2012，242(1-2)：39-46.

[28]La CR，Carbone F，De VR，et al. Immunometabolic profiling of T cells from patients with relapsing-remitting multiple sclerosis reveals an impairment in glycolysis and mitochondrial respiration[J]. Metabolism，2017，77：39-46.

[29]Janssens K，Van den Haute C，Baekelandt V，et al. Leukemia inhibitory factor tips the immune balance towards regulatory T cells in multiple sclerosis[J]. Brain Behav Immun，2015，45：180-188.