非小细胞肺癌患者肿瘤组织多驱动基因联合检测及其临床意义

杨长绍，杨延龙，丁晓洁，杜亚茜，李 权，郭银金，刘俊熙，周永春

近年肺癌在我国发病率逐年增加，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)最为常见，占肺癌的80%～85%。随着肿瘤分子生物学的发展，NSCLC靶向治疗备受关注，选择合适的患者进行靶向治疗是其成功的关键。目前，NSCLC患者仅局限于少量突变位点的检测，有相当部分患者因未能及时检测相关突变而错失最佳治疗方案，延误治疗时机。因此，通过多基因联合检测可加快有效筛选目标人群，以实现在患者病程早期接受特异的针对性治疗，减少毒副作用，提高治疗效果。本文收集86例NSCLC患者行EGFR、ALK、ROS1及KRAS基因突变检测，着重分析EGFR、ALK、ROS1及KRAS基因突变与患者性别、年龄、组织学类型、淋巴结转移、吸烟史等临床病理特征的相关性，为临床医师合理选择治疗方案实施个体化治疗提供有力的证据。

1 材料与方法

1.1临床资料选取云南省肿瘤医院2015年8月～2016年10月NSCLC手术标本86例。所有肿瘤标本均行10%中性福尔马林固定、石蜡包埋、切片及HE染色，由年资较高的病理医师复阅切片明确诊断，并确定有足够的肿瘤细胞进行后续检测。86例NSCLC患者中，男性42例，女性44例；患者年龄33～85岁，中位年龄55岁；腺癌71例，非腺癌15例；有淋巴结远处转移30例，未转移56例；曾经或正在吸烟者31例，无吸烟史者55例。

1.2DNA及RNA提取用二甲苯及75%乙醇擦拭刀片、切片机刀座、镊子，保证无交叉污染，连续8 μm厚切片5～8张，按福尔马林固定石蜡包埋样品DNA/RNA共分离试剂盒(厦门艾德公司)提取基因组DNA及RNA，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。提取DNA保存在-20 ℃冰箱，RNA保存在-70 ℃冰箱备用。

1.3ARMS法人EGFR基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)及人KRAS基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)均购于厦门艾德公司。根据试剂盒说明书检测EGFR及KRAS基因突变。荧光定量PCR仪为StratageneMx3000P型。PCR反应参数：第一阶段：95 ℃ 5 min，循环1次；第二阶段：95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，15个循环；第三阶段：93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，31个循环；并在第三阶段60 ℃时收集FAM和HEX信号。突变结果判断根据试剂盒说明书判读原则进行。

1.4RT-PCR人ALK基因融合和ROS1基因融合联合检测试剂盒(荧光PCR法)购于厦门艾德。根据试剂盒说明书进行操作，取出反应管，室温解冻后，快速离心后置于冰架上，分别加入逆转录酶及待测样品RNA。42 ℃保温1 h，95 ℃保温5 min后冰上冷却，得到cDNA溶液用于PCR扩增。取出已预分装的八连管，在冰上融化后短暂离心，并按试剂盒说明书要求分别加入样本cDNA、阴阳性对照，盖紧管盖，离心后置于荧光定量PCR仪上扩增。PCR反应参数：95 ℃ 5 min，1个循环；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s循环15次；93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s循环31次。荧光信号收集时设定为FAM荧光信号，在60 ℃设置荧光信号收集。

1.5统计学分析采用SPSS 13.0软件进行统计学分析基因突变与患者性别、年龄、组织学类型、淋巴结转移、有无吸烟等临床病理特征的相关性，χ2检验或者确切概率法分析是否具有统计学意义，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1EGFR、KRAS、ALK及ROS1基因突变频率与类型86例患者中，EGFR基因总突变率为47.7%(41/86)，其中EGFR基因Exon18 G719X(9.8%)、Exon19 del(36.6%)、Exon20 ins(2.4%)、Exon20 T790M(2.4%)、Exon21 L858R(29.3%)、Exon21 L861Q(4.9%)，6例患者(14.6%)出现双突变，分别为3例(7.3%)Exon18 G719X与Exon21 L861Q双突变，1例(2.4%)Exon18 G719X与Exon20 S768I双突变，1例(2.4%)Exon21 L858R与Exon18 G719X双突变，1例(2.4%)Exon21 L858R与Exon20 S768I双突变(图1)。KRAS基因总突变率为5.8%(5/86)，5例KRAS基因突变均为第12位密码子的突变，分别为3例(60%)Gly12Cys，1例(20%)Gly12val及1例(20%)Gly12Cys、Gly12val双突变；ALK基因融合率为8.1%(7/86)，其中1例患者存在Exon19 del与ALK融合共存，采用厦门艾德公司人EGFR/ALK/ROS1基因突变联合检测进行验证，结果一致(图2)；ROS1基因融合率为2.3%(2/86)。

2.2EGFR、KRAS、ALK及ROS1基因突变与NSCLC临床病理特征相关性EGFR基因在腺癌患者中的突变率为54.9%(39/71)高于非腺癌患者(28.6%)，两者的差异有统计学意义(P=0.007)；女性患者的突变率为65.9%(29/44)高于男性患者(28.6%)，两者之间的差异有统计学意义(P=0.001)；与患者年龄、是否吸烟、有无淋巴结转移无明显相关(P>0.05)。KRAS、ALK、ROS1基因与NSCLC临床病理特征无明显相关性(P>0.05，表1)。

图1 NSCLC患者EGFR基因突变的分布情况(n=41)

图2 EGFR基因外显子19缺失突变(曲线M)，ALK基因重排(曲线R)，曲线PC为阳性对照，NC为阴性对照

3 讨论

近年肺癌分子靶向治疗的领域研究，主要集中在EGFR、ALK、ROS1及KRAS靶点上[1-4]。EGFR基因在43%～89%的NSCLC中表达上调，参与细胞的增殖、血管生成、抗凋亡和肿瘤侵袭，在肿瘤的形成以及介导瘤细胞的生物学行为发挥重要作用，是目前NSCLC治疗的重要靶点之一。EGFR作为治疗NSCLC的分子靶标受到普遍关注，吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、埃克替尼(icotinib)等EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-tyrosine kinaseinhibitor, EGFR-TKI)已广泛应用于临床。位于EGFR下游的KRAS基因，其突变状态与患者服用抗EGFR的靶向治疗药物疗效密切相关，携带KRAS突变的癌症患者对上述药物的响应率明显下降[4]。ALK融合基因是NSCLC的驱动基因，也属于酪氨酸激酶，而克唑替尼是一种新开发的ALK酪氨酸激酶抑制剂，对ALK阳性NSCLC具有类似于EGFR-KTI的疗效[5]。基于其良好的疗效和耐受性，2013年初CFDA已批准克唑替尼用于治疗局部晚期或转移性ALK阳性NSCLC患者。近年在NSCLC患者中还发现ROS1受体酪氨酸激酶染色体重排，ROS1是基因编码胰岛素受体家族中的受体酪氨酸激酶，该激酶与细胞生长、增殖等密切相关。2015年4月克唑替尼被FDA授予突破性药物资格，用于ROS1阳性NSCLC的潜在治疗，2016年美国国立综合癌症网络(NCCN)临床实践指南中明确提出克唑替尼可用于ROS1融合的NSCLC治疗[2]。因此，准确检测NSCLC患者EGFR、KRAS、ALK及ROS1基因的突变状态，有助于筛选适合EGFR-TKI及ALK抑制剂治疗的人群。

表1 EGFR、KRAS、ALK及ROS1基因改变与NSCLC临床病理特征的相关性[n(%)]

*代表1例患者存在EGFR 19缺失突变与ALK融合共存

目前，EGFR及KRAS基因突变检测的方法很多，包括直接测序法、ARMS、片段长度分析及变性高效液相色谱技术等[6]。直接测序法是最直接、可检测已知和未知突变的方法，也是目前广泛应用的EGFR基因突变检测法，但由于该方法灵敏度相对较低，对样本量较少的标本及穿刺、内窥镜活检小标本，不能敏感的检测出突变。ARMS法检测灵敏度比直接测序法高，检测周期短，可对穿刺标本及细胞学标本进行检测，且扩增时闭管操作的特点，极大程度避免扩增产物的污染，易于在临床样品中检测开展。ALK及ROS1融合基因的检测方法主要有荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)、免疫组化和RT-PCR等[7]。免疫组化法因其具有简便易行、价格便宜、操作方法成熟等特点应用较广，但该方法灵敏度低，且不能明确融合基因型；FISH能特异和灵敏地检出ALK融合基因，是目前检测ALK融合基因的经典方法，但价格昂贵，操作规范要求较高，检测结果难以判读、主观性强等不足，在实际应用上还存在一些限制；RT-PCR技术简单快速准确，可以明确融合基因型，适用于微量组织标本，因而RT-PCR技术在筛选和确认肺癌基因重组中具有独特的优势。本实验采用ARMS及RT-PCR法检测EGFR、KRAS、ALK和ROS1基因改变，取得较为满意的效果。

86例NSCLC患者中，女性患者占51.2%(44/86)，EGFR基因突变率为65.9%(29/44)，显著高于男性患者突变率28.6%(12/42)，差异有统计学意义(P=0.001)。腺癌患者占82.6%(71/86)，其EGFR基因突变率54.9%(39/71)显著高于非腺癌患者13.3%(2/15)，差异有统计学意义(P=0.007)。吸烟患者占36.0%(31/86)，其EGFR基因突变率占41.9%(13/31)，非吸烟患者突变率50.9%(28/27)，吸烟与非吸烟患者差异无显著性(P>0.05)，与相关文献报道[8]EGFR突变常见于女性、非吸烟、腺癌存在差异。在NSCLC治疗中，EGFR基因是重要的生物学标志物，其敏感突变最常见，与临床疗效最为相关的突变包括19外显子缺失突变及21外显子L858R突变，本组这两类经典突变约占所有EGFR突变的70.7%(29/41)；目前20外显子的T790M突变的作用也比较明确，与EGFR-TKI原发及继发耐药相关，本组1例(1.2%)发生T790M突变；除上述突变外，EGFR基因其他位点突变，如G719X、L861Q、S768I等临床突变率较低，常常倾向于以联合突变的形式存在，本组有6例患者14.6%(6/41)存在双突变，分别为3例(7.3%)G719X和L861Q双突变，1例(2.4%)L858R和G719X双突变，1例(2.4%)L858R和S768I双突变，1例(2.4%)G719X和S768I双突变。Chiu等[9]发现EGFR基因G719X、S768I联合突变与单突变相比，EGFR双突变可能对ATP亲和力更强，对EGFR-TKI更敏感，因而EGFR-TKI治疗具有较高的客观缓解率及较长的无进展生存期。

KRAS基因在NSCLC中突变比率15%～25%，中国人群突变比率约为7%，常见突变位于12、13、61密码子突变，且近97%的KRAS基因突变涉及密码子12及13。本实验86例NSCLC患者中KRAS基因突变率为5.8%(5/86)，分析发现5例KRAS基因患者均为第2外显子中12密码子的突变，与报道[10]一致。关于KRAS基因突变与临床病理特征相关性，86例患者中KRAS基因在非吸烟患者突变率7.3%(4/55)高于吸烟患者3.2%(1/30)，但两者差异无统计学意义(P=0.441)，与Forbes等[10]报道KRAS基因突变与吸烟史密切相关，在非吸烟的患者中KRAS转换突变(G→A)常见，而移位突变(G→T或G→C)在曾经吸烟和正在吸烟的患者中不相符合；KRAS基因突变与其他临床病理特征相关性，如患者性别、年龄、组织学类型、淋巴结转移均无明显相关(P>0.05)，这与Riely等[11]报道一致。目前，对于KRAS基因突变NSCLC患者治疗，大部分研究[4,10]显示KRAS基因突变与肺癌患者对EGFR-TKI的原发耐药有关，利用KRAS基因检测可以为EGFR-TKI药物治疗患者的筛选提供重要参考。

EML4-ALK是在NSCLC中第一个发现的融合基因激酶抑制靶点，在肺腺癌中的发生率为6%～7%[12]。本实验中EML4-ALK发生率为8.1%(7/86)，其中1例患者存在EGFR 19缺失突变与ALK融合共存。在多数病例中，EML4-ALK融合与其他致癌基因(如EGFR或KRAS)突变不重叠[13]，但也有文献[14]报道ALK和EGFR存在双突变。Ren等[13]报道 EML4-ALK融合基因是NSCLC常见的临床亚组，其典型的临床特征包括：男性、年轻患者、非吸烟或少吸烟、腺癌或以腺癌细胞为主的病理类型。本组中ALK基因重排与患者性别、年龄、组织学类型、是否吸烟、有无淋巴结转移无明显相关(P>0.05)。

ROS1基因是NSCLC中的另一个融合基因激酶抑制靶点。Takeuchi等[15]报道肿瘤融合基因检测显示ROS1基因可以与TPM3、SDC4、EZR、LRIG3、SLC34A2和CD74融合形成多种ROS1重排亚型，ROS1融合在NSCLC患者中阳性率约2%，并被公认为肺癌中致癌突变。本实验中ROS1基因融合发生率为2.3%(2/86)，与文献报道接近。ROS1基因融合阳性与ALK重排阳性的NSCLC患者具有相似的临床病理特征，即为年轻、非吸烟且为高度恶性趋势的肺腺癌患者[16]，但本实验中ROS1基因融合与患者性别、年龄、组织学类型、是否吸烟、有无淋巴结转移无明显相关(P>0.05)，我们在后续的实验中将扩大样本量进一步验证。

综上所述，NSCLC患者中EGFR基因突变和ALK融合基因均存在较高的突变率，KRAS、ROS1基因改变以及驱动基因双突变共存型基因突变率虽低，但不容忽视。2016年美国NCCN临床实践指南除了继续推荐对于复发或转移的NSCLC患者进行EGFR突变和EML4-ALK重排检测外，更强调治疗初期的多重基因检测。通过多基因检测可以实现在病程早期接受特异的针对性治疗，减少毒副作用，提高治疗效果，对临床上加快有效筛选目标人群有重要意义。

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