载脂蛋白E基因多态性与他汀类药物降脂疗效的关系

宁昕，邱龄

他汀类药物是羟甲基戊二酰基辅酶A （HMG-CoA）还原酶（胆固醇合成过程的限速酶）的抑制剂，通过降低胆固醇生物合成和激活低密度脂蛋白受体（LDLr）降低胆固醇，是心血管疾病一级和二级预防的重要药物。然而，他汀类药物治疗效果差异很大[1]，许多患者不论如何增加他汀类药物剂量，仍无法达到血浆胆固醇目标水平。除了饮食运动、个体依从性、副作用等因素，个体之间的遗传差异是很重要的原因。

研究发现，APOE的3种共显性等位基因ε2，ε3和ε4对他汀类药物的降脂疗效具有最强的关联而且此类研究经常重复验证。APOE是血浆脂蛋白中具有运输脂类功能的一种蛋白质，它主要存在于乳糜微粒（CM）、极低密度脂蛋白（VLDL）和部分高密度脂蛋白（HDL）中[2]。近年来，涌现了许多关于APOE对他汀类药物降脂疗效的大型药物基因组学研究，可能因为人群、饮食、运动、性别分布、年龄分布、他汀药物种类和剂量等的差异，结论并不完全一致。本综述将对APOE的研究历史和生理功能进行简要描述，解释产生APOE基因多态性的分子生物学基础和对血脂的影响，最后综述和讨论近年来APOE基因多态性对他汀类药物降脂疗效的不同影响的研究证据。

1 APOE

1.1 APOE的结构和功能1973年Shore等通过凝胶电泳方法研究VLDL异质性时首次发现一种富含精氨酸的蛋白质，也就是APOE。Rall等发现APOE是一个包含299个氨基酸，分子量为34kDa的糖基化蛋白，主要由肝细胞合成和分泌。随后的研究发现，APOE的重要生理功能是作为脂蛋白的配体参与脂质重新分配[2,3]，它可以介导部分脂蛋白（即CM、VLDL和部分HDL）与LDLr的高亲和性结合，引起脂蛋白的吸收和降解；同时，APOE还介导脂蛋白残粒与另一种肝内受体（残粒受体或APOE受体或LDL受体相关蛋白LRP）的结合[4]。另外，APOE在脂蛋白表面的富集可以减慢三酰甘油被脂肪酶脂解的速率，由此引起APOE不同亚型脂质代谢的区别[2,3]。

1.2 APOE基因多态性1975年Utermann等用等电聚焦的方法发现了APOE基因表型存在多态性。1981年Zannis等用二维凝胶电泳法揭示了APOE的3种共显性等位基因（ε2、ε3、ε4）和由3种纯合表型（E4/4，E3/3和E2/2）及3种杂合表型（E4/3，E3/2和E4/2）组成的6种表型。

APOE基因位于人类第19号染色体上，长度为3.6 kb，有4个外显子和3个内含子，编码317个氨基酸[2,3]。在所有异构体中，ε3最常见，因此被认为是野生型，ε2和ε4被认为是变体[3]。ε3的频率范围从50%至90%，ε4的频率范围约为5%～35%，ε2约1%～15%[2]，这种区别可能跟地理和种族有关。基因多态性表现为APOE亚型对LDLr的亲和力差异，E4的体外受体结合活性与E3相似，但E2只有E3的2%或者更少的亲和力。

胆固醇通过受体（肝细胞膜上的LDLr、残粒受体）介导的内吞作用进入细胞，引起LDLr和HMG-CoA还原酶的下调，由于E2对LDLr的结合缺陷，含有APOE2的脂蛋白胆固醇延迟分解，引起LDLr的上调，从而提高了低密度脂蛋白（LDL）的摄取，降低了血浆LDL水平。另外，这种延迟分解抑制了中间密度脂蛋白（IDL）向LDL的转化，也降低了LDL水平。E4则正好相反[5]。其次，因为氨基酸和脂蛋白结合域的相互作用，APOE4优先结合较大的富含三酰甘油的VLDL，而APOE3和APOE2没有这种相互作用，所以结合较小的、更多磷脂富集的HDL[6]。有一些证据表明，胆固醇在小肠的吸收速率似乎也受APOE基因多态性影响，携带ε4等位基因的人可以更有效的吸收胆固醇和减少胆固醇的合成。再加上APOE在细胞表面富集的影响，总的结果是，相对于ε3等位基因，ε2等位基因往往与APOE和TG水平升高、载脂蛋白B（APOB）和总胆固醇（TC）水平下降有关；相反，ε4等位基因与APOE和TG水平下降、APOB和TC水平升高有关[2]。

随着人类基因组测序工程的发展，APOE基因上的一些重要的单核苷酸多态性（SNP）被发现与三种异构体有关。ε2/ε3/ε4由SNP rs429358（“C”等位基因）和SNP rs7412（“T”等位基因）定义，由于这两个SNP不在人类基因组单体型图谱II（HapMap Ⅱ）中而且和其他SNP存在强连锁不平衡（LD），通常分别由SNP rs4420638（“G”等位基因）和SNP rs445925（“A”等位基因）定义ε2和ε4变体[7]，分别与更好的和更差的他汀药物降脂疗效有关。

2 APOE基因与他汀类药物

2.1 APOE基因与他汀类药物降脂疗效的候选基因关联研究通过APOE生理功能推断APOE对他汀类药物作用机制可能是以下两个方面：第一，含APOE4的脂蛋白胆固醇迅速代谢进入细胞，引起HMG-CoA还原酶的下调；第二，ε4等位基因导致内源性胆固醇合成减少，由于HMG-CoA还原酶是胆固醇合成过程的限速酶，HMG-CoA还原酶的作用被削弱，两方面因素共同抑制了他汀类药物的作用。所以，从机制上来说，ε4等位基因携带者表现为胆固醇和三酰甘油的升高、HDL的降低。但实际情况要复杂的多。

有将近60个研究致力于明确APOE基因和他汀类药物降脂疗效的关系，但是由于研究设计或者人群、地理位置的原因，每个研究的特征都不相同。早先的研究大都是始于北欧的家族性高胆固醇血症（FH）患者的小样本研究，因为从APOE基因的地理分布上来说，ε4等位基因频率在北半球由北向南呈现递减趋势。荷兰一个包含120名白种人FH杂合子患者的研究发现，使用辛伐他汀时E3/4或E4/4的血脂变化最小，但没有统计学意义。对此，O'Malley解释为FH患者的LDLr被抑制，APOE已经产生不了影响。显然，由于FH患者的LDLr缺陷，这类患者已经不适合用于评估APOE基因的作用[8]。美国的一项随机对照研究分析了基因-性别相互作用[9]，试验包含328个样本，药物是阿托伐他汀10 mg，随访1年后发现男性APOE基因型之间广泛的血脂谱变化的差异，而女性则没有这种差异，携带ε2等位基因的男性对降脂治疗更敏感。由Carmena发表的研究与此类似，APOE似乎不影响女性对他汀类药物的降脂疗效，男性群体更容易得出阳性结论[10]。但是这一基因-性别作用的机制尚不明确，可能是由性激素调节LDLr等重要脂代谢途径引起。

最近Lagos等的研究结果与预期相同，他发现美洲印第安人中E3/4与E3/3相比胆固醇降低的更少，[低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的降低分别是-18%和-29%，P≤0.001]，而且在TC、三酰甘油的降低和HDL-C的升高上，E3/3均表现出更高的敏感性且有统计学意义[11]。但是这个研究排除了E2携带者。Cerda等研究了巴西人群应用阿托伐他汀的疗效差异，发现APOE各基因型人群治疗前后血脂变化在基因型之间无统计学差异[12]。而Baptista等对血脂异常患者随访（应用多种他汀类药物）后发现与ε4等位基因携带者相比，非ε4等位基因携带者总胆固醇显著降低（P=0.003）[13]。2005年Thompson等发表了最大的他汀类药物疗效的随机开放研究，包含近4000个样本，多种他汀类药物及43个SNP，证实了ε2（rs7412）杂合子和LDL-C降低产生最强的相关性（降低了39.9%）[14]。

以心血管事件为终点的辛伐他汀生存研究（4S）包含966例北欧心肌梗死患者，中位随访时间为5.5年，安慰剂组携带ε4等位基因的患者比非E4携带者的死亡风险高1.8倍（95%CI：1.1～3.1），辛伐他汀组E4携带者和非E4携带者生存曲线一致，说明对E4携带者来说，辛伐他汀治疗获益更多，但是LDL-C的降低在E4和非E4携带者中没有区别，ε4等位基因的致死作用可能不只由血脂变化引起[15]。之后一个类似的更大的普伐他汀生存研究纳入了3304例意大利心肌梗死患者，随访中位时间为24.3个月，同样观察到E4携带者经普伐他汀治疗后死亡率的显著降低，但是没有提供血脂变化的数据[16]。两个研究最大的不同在于地理位置和饮食等因素造成的ε4等位基因频率和死亡率的不同，但仍获得了关于死亡率改善的一致的结论。然而，荷兰的一项研究（包括7983名受试者）[17]发现，他汀类药物对心肌梗死和中风的保护作用以及治疗对总死亡率的改善与APOE基因型无关，可能是由于该研究仅纳入55岁以上人群，增加了一些未知的混杂因素。后来该作者发表了REGRESS研究（一项双盲安慰剂对照多中心研究，包括815例男性高胆固醇血症患者）的子研究，证实了普伐他汀对E2携带者更好的治疗效果[18]。

关于瑞舒伐他汀仅有1项研究，没有发现APOE基因多态性与他汀类药物降脂疗效有统计学关联[19]。近期，张宇等对962例中国高胆固醇血症患者进行研究，发现相对于E3/4，E3/3型患者对阿托伐他汀更敏感[20]。每种类型的药物研究均发表了结果符合预期（E2高反应性和E4低反应性）和关联无统计学意义的情况，说明他汀类药物种类和剂量对APOE各基因型的他汀类药物降脂疗效并无太大预测价值。所以对于基因检测为E4的人群，换用其他他汀类药物效果不大。

2.2 全基因组关联研究（GWAS）和系统评价候选基因关联研究往往受样本量大小、地域等因素的影响，可重复性差，仅关注候选基因的遗传标记，而且所选择的基因在多大程度上受到LD的影响不得而知；而GWAS的研究方法较一致（常测试上百万位点上的SNP数据）且样本量高，其研究结果比候选基因关联研究更一致和有意义。

第一个他汀类药物降脂疗效的GWAS是TNT研究（也包含候选基因分析）[21]，在候选基因分析中发现APOE的SNP rs7412与LDL-C变化最相关（P=6×10-30），但是由于其低最小等位基因频率（MAF）和低LD在GWAS中被遗漏，没有发现其它有意义的SNP，年龄和性别结合起来对预测阿托伐他汀降脂疗效甚至更佳。HPS研究同样没有在全基因组中发现有统计学意义的遗传关联，而在候选基因关联研究中发现了包括APOE在内的5个基因和LDL-C变化有关[22]。JUPITER试验证实了ABCG2（ABCG2）（rs2199936）、LPA（apolipoprotein a gene）（rs10455872）和APOE（rs7412）对瑞舒伐他汀诱导的LDL-C降低最相关[23]。CARDS/ASCOT研究中发现LPA的rs10455872和APOE的rs445925、rs4420638与阿托伐他汀降脂疗效有显著关联[7]。终点为心血管事件的研究没有发现有关联意义的位点[24]。此外，还有一些小样本量的他汀类药物降脂疗效的GWAS未发现有统计学意义的APOE基因位点。

常见变异可以通过GWAS发现复杂性状遗传关联，但是未检测出的罕见变异或许更有意义，随着全基因组SNP芯片费用的下降和高通量测序技术的发展，可以检测出更全面的SNP位点，或许能够强调我们的猜想或者发现从未被怀疑过的新的基因位点。

1995年的第一个meta分析包含625例受试者，证实与E3/3相比，E2携带者和更多的LDL-C降低有关（P＜0.05），E4携带者和更少的LDL-C降低有关（P＜0.05）[25]。Zintzaras等的meta分析纳入了24个研究，证明APOE基因型与他汀类药物导致的降血脂作用的关系没有统计学意义[26]。CAP/PRINCE/TNT的综合分析包括3932个对象，证实了CLMN（rs8014194）和总胆固醇降低的强烈关联，APOC1和APOE附近的rs4420638与LDL-C变化的中度关联[27]。Postmus等综合了19个他汀类药物降脂疗效的研究（包括随机对照试验和观察性研究，40000多个样本），发表了迄今为止最大的GWAS的meta分析，证实APOE和LPA对他汀类药物导致的LDL-C的降低具有显著关联（rs445925和rs10455872）[28]。

此外，Leusink等用简单相加遗传风险评分（SC-GRS）评估了ABCG2、LPA、APOE中的SNP对他汀类药物降脂疗效的影响，结果证明GRS与他汀类药物诱导的LDL-C降低在每个等位基因有2%的关联[29]。然而，Ciuculete等使用加权GRS方法强调了rs7412（APOE）等位点与他汀类降胆固醇能力的高度关联[30]。

但是近期的系统评价综合分析了影响LDL-C水平的59个SNP和几个大型他汀类药物试验，证明具有高LDL-C水平遗传倾向（APOE rs4420638、SORT1 rs629301、NPC1L1 rs2072183）的个体他汀类药物降脂疗效较差[31]。一些研究在调整了他汀类药物种类、剂量和遗传变异对基线LDL-C的影响后，仍能观察到有意义的结果[7,28]。上述结果与早期的一个多因素线性回归分析结果完全不同，该研究发现APOE基因多态性仅解释了男性LDL-C水平变化个体差异的2%，而基线LDL-C水平是41%，更高的基线LDL-C水平意味着更好的反应性[9]。可能是因为样本例数太少，而且除年龄和身体质量指数（Body Mass Index，BMI）外还有一些混杂因素没有校正。

同样，来源于REGRESS研究的子研究还发现了一些基因-基因交互作用更好的预测他汀类药物的降脂疗效，比如APOE2和ACE I/D（the insertion/deletion polymorphism in the angiotensin-converting enzyme gene，ACE I/D）、TLR4Gly（the Asp299Gly polymorphism in the Toll-like receptor 4 gene，TLR4Gly）[32]。除了激素、性别，其他APOE的基因-环境交互作用可能也解释了他汀类药物疗效差异的一部分，如饮食、运动、吸烟、BMI、血糖等因素。

3 小结

综上所述，目前认为他汀类药物的降脂疗效差异是多基因遗传和环境等因素共同作用的累加效应，遗传因素中最显著的是APOE的SNP rs7412（定义ε2变体），其与他汀诱导的LDL-C降低有关，多项研究显示与他汀类药物种类和剂量、基线LDL-C水平无关，男性群体这种效应更明显，而且在对于总死亡率的改善上也有肯定的结论。尽管已经发现APOE对他汀类药物降脂疗效有影响，不论是在候选基因关联研究还是全基因组关联研究中，但是其在整个他汀类药物使用者个体之间疗效差异中的影响所占比例仍然存在很大分歧，是否有助于发现他汀类药物疗效差的个体还有赖于进一步研究。而且由于ε2、ε4等位基因的低MAF，其在基于家系而不是人群的研究上或许更有贡献。将APOE基因对他汀类药物降脂疗效的这种效应用于指导临床治疗的获益程度尚未达成共识。但是，目前大型的随机对照试验或者前瞻性研究大部分仅入选欧洲人群而且在罕见变异的检测上还有不足，在其它地区进行研究或者在更大型的GWAS中是否会出现更加有意义的结果或者在新药靶点的研究上，都需要进行更进一步的努力。