明胶/聚己内酯纳米纤维电纺膜在组织工程中的应用进展

2018-01-15燕丽郑蕊沈征宇

组织工程与重建外科杂志 2018年3期

燕丽郑蕊沈征宇

【提要】天然高分子材料明胶（Gelatin，GT）和人工合成高分子材料聚己内酯（Polycaprolactone，PCL），两者都具有良好的生物相容性和可降解性，已被应用于组织工程研究领域。然而，单一组分的GT和PCL材料存在诸多缺点。GT/PCL复合材料克服了单一组分支架存在的缺点，具有理化性能佳和组分优势互补等特点，可应用于构建组织工程器官和修复组织损伤。本文对GT/PCL纳米纤维电纺膜的特征及其在组织工程多个领域中的应用研究现状进行系统性回顾。

组织工程中的支架材料提供类似于细胞外基质的替代结构，使得种子细胞能够依附其上，并通过在特定环境下的培养，最终形成特定的器官或组织。在新生细胞外基质的形成、沉积和构形过程中，支架材料被逐渐降解，最终留下能够恢复、维持或改善组织功能的重要器官或组织[1]。

生物支架材料可大致分为两类：可降解性天然高分子材料和人工合成高分子材料。可降解性天然高分子材料，如明胶（Gelatin，GT）等，具有不引起炎症和免疫排斥反应，细胞相容性好等优点，但不易加工，强度不够，降解速率和组织再生的速度难以匹配[2]；人工合成高分子材料，如聚己内酯（Polycaprolactone，PCL）等，强度和降解速度可调，整体结构和表面设计合理，但生物相容性不佳，易引起排斥反应[3]。

将天然和人工合成高分子材料复合，可克服单一组分的缺点，达到优势互补并改进理化性能。复合方法主要包括化学交联[4]、光交联[5]、热交联[6]、静电纺丝技术等。静电纺丝技术是通过高压静电场，将符合目标组织化学和生物物理要求的组分交联，制作亚微米至纳米级的复合型支架的常用技术[7]，能制作纳米级的超薄纤维，可模拟机体多种组织和器官的细胞外基质环境；能造就高孔隙率，增大材料表面积/体积比，便于物质转运和代谢；可根据需求载入聚合物、无机物、生物大分子等，扩大应用范畴；方法简便、直接、成本较低[2]。

GT/PCL纳米纤维电纺膜由GT和PCL交联制备得到，以此为支架材料，已进行了大量组织工程的相关研究。本文将从GT/PCL纳米纤维电纺膜的特征及应用等方面进行综述。

1 GT/PCL纳米纤维电纺膜的特征

①相比于单纯的GT和PCL，GT/PCL复合能提供更佳的亲水性和细胞亲和力，且该复合材料支架可不断释放GT蛋白分子，为细胞的附着和增殖创造良好的环境。②GT/PCL复合材料孔隙率佳，且GT在细胞培养过程中逐渐溶解，为细胞迁移提供了更多的空间。③GT/PCL复合材料强度较PCL降低，具有较好的伸展和变形特性，可使细胞进入支架的深层，便于定植[8-9]。④相比于化学交联法，GT/PCL纳米纤维电纺膜在很大程度上避免了化学交联剂的潜在细胞毒性[2]。

2 GT/PCL纳米纤维电纺膜的应用

GT/PCL纳米纤维电纺膜孔隙率适宜、形态均匀、纤维空间排布良好，为细胞的增殖和分化提供良好的环境，能促进细胞黏附和定植相关的生长因子[10-11]，可激活分化早期的Wnt/β-连环蛋白信号通路，促进鼠源性诱导性多能干细胞分化[12]。这些特征为其在组织工程领域中的应用奠定了基础。

2.1 在血管组织工程中的应用

GT/PCL纳米纤维电纺膜结合内皮细胞（ECs）或干细胞可构建组织工程微型血管。Ma等[13]将ECs与GT/PCL纳米纤维电纺膜二维共培养，发现ECs与材料复合良好，移行和增殖速率增加，能稳定持续表达3种血管性重要标志物：血小板内皮细胞黏附因子-1、细胞间黏附因子-1以及血管细胞黏附因子-1。Kook等[14]构建了GT/PCL纳米纤维电纺膜与人脐静脉内皮细胞（hUVECs）、脂肪间充质干细胞（ADSCs）共培养体系，ADSCs能通过胞间联系和旁分泌作用促使hUVECs向ECs转化并分泌更多的血管生成因子，促进血管形态发生；经GT/PCL纳米纤维电纺膜的三维培养，可形成血管内腔结构。

2.2 在骨组织工程中的应用

GT/PCL纳米纤维电纺膜成分和力学性质类似于骨组织，可用于构建组织工程骨。Venogopal等[15]通过傅里叶变换红外光谱学分析发现，材料中含氨基酸基团、磷酸盐基团和羰基基团，均是成骨所必需的；力学测试显示，电纺膜屈伸度良好，强度符合骨组织构建要求。与单纯PCL电纺膜相比，GT/PCL纳米纤维电纺膜的大孔隙率显著增加了表面积，为营养物质的转运提供了充足空间，膜上成骨细胞生长状态良好，增殖率、碱性磷酸酶活性、骨分化程度均显著增加。Guo等[16]研究发现，GT/PCL纳米纤维空间方向性越一致、纤维延长率越高、排列越趋于均质，材料力学性能越好，成骨细胞种入后增殖率和碱性磷酸酶活性也越强。

2.3 在软骨组织工程中的应用

软骨组织主要是由软骨细胞和包含II型胶原、蛋白聚糖和其他糖胺聚糖的细胞外基质构成，其抗压和抗拉力强度主要由细胞外基质成分提供[17]。利用脱细胞软骨基质结合软骨细胞构建组织工程软骨十分困难。脱细胞软骨基质的细胞残留和低孔隙率易导致免疫排斥和软骨形成不完全[18]。GT/PCL纳米纤维电纺膜制备简单，成本较低，且能促进软骨三维结构的形成。Xue等[19]将软骨细胞接种于GT/PCL纳米纤维电纺膜，经过2周的体外培养获得类软骨组织，而后将其接种在钛合金耳郭模型上，移植至裸鼠皮下培养6周，可形成组织工程耳郭形状软骨，弹性和机械强度良好。Zheng等[20]就不同质量比例的GT/PCL对三维软骨再生的影响进行研究，各组均具有良好的软骨细胞相容性。低PCL质量比例组（GT∶PCL=70∶30）材料亲水性更强，软骨细胞分布更均匀，细胞外基质营养渗透更佳，柱状三维软骨结构早期形成情况更好，最终形态结构更为均质。对于精细且凹凸不平的耳软骨再生模型，仅低PCL组在移植体内12周后能够完全形成形态和弹性类似于的软骨结构。

2.4 在神经组织工程中的应用

GT/PCL纳米纤维电纺膜能够促进神经纤维的生长和促进干细胞向神经细胞的分化。Ghasemi-Mobarakeh等[21]将GT/PCL纳米纤维电纺膜与神经干细胞共培养，发现神经干细胞分化和增殖、神经纤维的增长和神经根形成，相比单纯PCL组均有显著增加。Li等[22]证实GT/PCL纳米纤维电纺膜不仅能促进神经元再生，还能作为不含神经元的支架模型促进少突胶质细胞轴突髓鞘形成。Karbalaeimahdi等[23]将GT/PCL纳米纤维电纺膜用于诱导人多能性干细胞（hiPSC）向神经细胞分化。发现hiPSC接种入膜后，经神经细胞分化诱导培养基孵育，hiPSCs几乎全部向神经细胞方向分化，分化率显著高于培养皿诱导分化组。

2.5 在皮肤组织工程中的应用

皮肤移植存在来源不足、免疫排斥等问题，皮肤组织工程为此提供了新的解决方案[24]。

GT/PCL纳米纤维电纺膜能够促进皮肤伤口愈合，并通过负载生长因子加速这一过程。Tigli等[25]将表皮生长因子（EGF）用化学共轭法连接在GT/PCL纳米纤维电纺膜上，再将鼠L929成纤维细胞接种在单纯材料组和负载EGF组上，结果显示负载组细胞增殖明显加快，伤口愈合更为完全。

2.6 作为生物活性物质载体的应用

生物活性物质提供营养、抵抗不良因素，促进种子细胞的生长和分化等。但难以长期稳定存在[26]。GT/PCL纳米纤维电纺膜能够结合并包裹生物活性物质，使之在可控条件下释放和发挥作用。它能通过结合相关生长因子促进组织器官修复[25，27－28]，还能用于药物的负载。 Xue 等[29]将甲硝唑溶于 GT/PCL混合液后进行混纺，虽然最初3天内仍有井喷式释放现象，但在接下来的3周内保持稳定而持续的缓释，培养皿厌氧菌培养结果显示细菌定植减少。当甲硝唑的浓度控制在30%以下时不表现细胞毒性，细胞能很好的黏附和定植在膜上。家兔体内实验表明，载MNA的GT/PCL纳米纤维电纺膜进入体内炎症反应小，降解速率适宜，机体感染率降低。Zhu等[30]将不同药物含量（1%、2%、4%）的 7-乙基-10-羟基喜树碱（SN-38）与GT/PCL进行混合电纺，体外药物释放试验表明，1%和4%含量的SN-38药物释放参数呈Fickan扩散，而2%含量的SN-38最符合Korsmeyer药代动力学模型，即缓释态势最佳，并显现出良好的生物可降解性和抗肿瘤作用。

2.7 在其他领域的应用

GT/PCL纳米纤维电纺膜可被用于研究肿瘤进程。Hartman 等[31]将串珠素Ⅳ区（Perlecan domain IV，PlnDIV）蛋白聚糖与GT/PCL纳米纤维电纺膜结合，其理化性质与骨髓微环境相似，成功建立了前列腺癌骨转移模型。接种前列腺癌细胞5 d后，观察到癌细胞黏附、渗入、增殖和应力纤维产生均显著增加，紧密连接蛋白表达减少，黏着斑激酶（FAK）酪氨酸397位点磷酸化增加，使得癌细胞增殖和转移更为容易。

GT/PCL纳米纤维电纺膜在口腔组织工程中也有很好的应用前景。Kim等[32]将PDL干细胞和GT/PCL纳米纤维电纺膜共培养，发现细胞按纤维方向排列，细胞特异性标记（如骨膜素和腱生蛋白）表达增加，骨形成标志物下调，说明PDL干细胞表型向韧带方向转化。