循环肿瘤细胞检测在晚期肿瘤患者维持治疗中的应用

连洁，杨宇

(哈尔滨医科大学附属第二医院肿瘤内科，哈尔滨 150001)

近年来，恶性肿瘤的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，成为威胁人类生命的重要原因之一。由于大多数晚期恶性肿瘤具有难以治愈的特点，临床治疗目标为改善生活质量、延缓肿瘤进展以及延长生存时间。“维持治疗”理念的提出正是契合了这样的诊疗现状和需要。2003年美国临床肿瘤学会指南中指出，一线诱导化疗方案不宜>6个周期。6个周期后继续使用该方案不但不能延长患者生存时间，反而易造成毒性积累以及生存质量的下降[1]。因此，行一线治疗4～6周期后达到最大缓解疗效但仍不能行手术切除的患者，将进入维持治疗阶段，直至疾病出现复发及进展时再行二线治疗。如果能及时评价维持治疗疗效，就能针对患者选择最优治疗方案，以延长患者生存期。但如何精准确定终止维持治疗的时机目前尚无统一标准，临床上通常使用肿瘤标志物、影像学检查及患者临床表现来评估肿瘤进展，进而更换二线治疗方案。及早预测及判断维持治疗期间疾病进展，及时更换治疗方案，对于延长晚期肿瘤患者生存期有重要意义。

近年来，循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)以其良好的敏感性、特异性、创伤小、取材方便及可重复性，受到临床医师的青睐。CTC是指由实体瘤或转移灶脱落进入血液循环的肿瘤细胞，是肿瘤患者出现术后复发和远处转移的重要原因[2]。CTC在肿瘤诊断、病程分期、预测疾病进展及评估化疗疗效等方面的作用已经得到验证。那么维持治疗期间使用CTC检测，是否可以更早地预测及判断疾病进展，从而精准确定开始二线治疗的时机？本文就此问题作以下综述。

1 CTC的提取分离和检测方法

CTC主要有2大类分离技术，分别是形态学方法和抗原抗体方法。形态学方法分为过滤法和梯度离心法。过滤法的原理是根据肿瘤细胞的体积大于白细胞体积分离CTC。梯度离心法是根据肿瘤细胞与白细胞密度不同，通过梯度离心分离CTC。抗原抗体方法分为阳性捕获法(免疫磁性分离)、阴性富集法(免疫磁性分离)以及负向筛选法。阳性捕获法的原理是采用抗上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)结合免疫磁珠捕获EpCAM阳性CTC。阴性富集法的原理是利用CD45磁珠抗体吸附白细胞，在磁场作用下去除白细胞，CTC被富集沉淀。负向筛选是基于免疫磁珠技术的富集原理，采用去除血液中肿瘤细胞之外的其他干扰成分(红细胞、白细胞、血浆蛋白等)的实验方法，达到富集CTC目的。此方法不依赖于肿瘤细胞大小及特异性抗原，所有种类的CTC、循环肿瘤微栓子(circulating tumour microemboli,CTM)等异常细胞都会被富集，是一种理想的CTC富集技术，异常细胞回收率高，可去除>99.99%的白细胞，肿瘤细胞回收率>80%，为进一步鉴定提供技术保障。

CTC的检测方法主要有实时荧光定量PCR[3]方法、微型芯片技术[4]和单细胞测序技术。其中单细胞测序技术为第3代检测技术。第3代测序技术不需要PCR扩增即可直接对单个分子进行测序；样品制备简单，测序成本进一步降低；可直接读取RNA的序列和包括甲基化在内的DNA修饰。这些优势可大大改善临床基因测序的成本、速度和质量等。Leung等[5]研究发现，1例患者通过单细胞测序发现肿瘤细胞在肝转移前出现大量突变，而且肝转移病灶恶性程度很高。在另一例患者的CTC和单细胞测序结果中，发现肿瘤细胞具有多克隆的种子，其中肝转移的2个克隆细胞与原发灶基因图谱完全不同，单个细胞的数据亦揭示了独立的肿瘤基因谱系；另外，数据还揭示了2例结直肠癌(colorectal cancer,CRC)患者转移的晚期传播模型，但当前CTC在检测方法上仍存在一定不足，需要更多大型的前瞻性试验研究。

2 CTC的临床应用

2.1 CTC与肿瘤早期诊断

受限于CTC的提取方法，以往的研究认为，只有晚期肿瘤患者才可以检测CTC。Jin等[6]在早期肺腺癌患者血液中检测到了CTC的存在，Chen等[7]亦研究了CTC对肺癌早期诊断的意义。

在肿瘤细胞中，Ki67指数是细胞增殖的生物标志物。有研究认为，CTC计数和Ki67指数具有潜在诊断CRC的价值。Yang等[8]在2017年研究中共纳入105例CRC手术患者，分别进行CTC计数和Ki67的表达免疫组织化学检查。结果发现，CTC计数和Ki67指数可作为CRC诊断的生物标志物，且独立于患者的性别、年龄、肿瘤大小和部位及肿瘤进展。有趣的是，Ki67指数被证明与肿瘤分化呈负相关。此外，CTC计数亦可作为CRC一种转移性相关的生物标志物，独立于Ki67指数。因此，使用CTC可对易感人群进行筛查，从而及早发现肿瘤的存在，以达到早期诊断、早期治疗的目的。

2.2 CTC与肿瘤分期

CTC高表达于部分肿瘤分期较早的肿瘤患者外周血中，可导致肿瘤的快速转移和复发，且CTC数值与肿瘤分期相关[9]。Sastre等[10]将每7.5 ml 外周血中≥2个CTC定为阳性，通过检测外周血中CTC的数量，发现CTC阳性率与结肠癌分期相关。

2.3 CTC与肿瘤个体化医疗

CTC可用于检测肿瘤治疗相关的基因突变或蛋白，获取患者基因信息，从而指导患者个体化治疗[11]。随着基因检测技术迅速发展，人们发现针对靶向基因的药物可获得很好的疗效。Maheswaran等[11]在接受吉非替尼治疗的非小细胞肺癌患者CTC中，检测到表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)T790M突变，且结果与肿瘤组织检测保持一致。He等[12]分别检测了CTC、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,CTDNA)以及组织活检中EGFR突变的情况，得到95%的一致率。可见在难以获得病理标本的患者中，可考虑利用CTC检测替代组织活检判断患者基因突变情况。但受限于CTC分离等技术上的难题，目前临床上仍未广泛应用CTC来指导靶向治疗。

2.4 CTC与肿瘤预后

CTC是一种反应肿瘤负荷的独立指标。研究显示，观察患者治疗前及治疗过程中外周血CTC数目的变化，有助于评估肿瘤进展及药物治疗疗效。有研究发现[13]，在非转移性三阴性乳腺癌患者中，每7.5 ml血液中CTC>2个的患者无进展生存期和总生存期较CTC<2个者短。Rahbari等[14]研究发现，CRC患者的预后与CTC数量有关。CTC数量越多，患者5年生存率越低，预后越差。另有研究表明，检测CTC可预测转移性前列腺癌的总生存期以及多西他赛的治疗效果[15]。因此，检测CTC的数量多少并记录化疗前后的数量变化，可反映肿瘤的预后及化疗疗效。

3 维持治疗期间CTC的应用

维持治疗作为由一线到二线的过渡治疗，其益处已经得到广泛的认可。维持治疗的停药指征为出现疾病进展或不可耐受的不良反应。尽早发现维持治疗期间的疾病进展以便调整治疗方案，可改善并延缓病情进展。临床医师大多利用肿瘤标志物、影像学检查的实体瘤疗效评价标准(1.1版)[16]及患者临床表现来评估肿瘤进展，以判断终止维持治疗的时机。这种方法有一定局限性。(1)肿瘤标志物只能用于协助判断；(2)局部的影像学检查不能完全判断全身情况；(3)临床表现有极大的主观性。因而使用以上方法不能及时地反映肿瘤进展。在这种情况下，是否会错误判断维持治疗的终点，从而延误开始二线化疗的时机呢？研究者开始尝试其他检测肿瘤进展的方法。近年来研究发现CTC可以比影像学检查更早发现化疗过程中出现的疾病进展[17]。

研究者针对人EGFR2阴性的胃癌患者，制定了贝伐单抗、卡培他滨、奥沙利铂及多西他赛联合治疗6周期后，再用卡培他滨联合贝伐单抗维持治疗的方案。其结果为，CTC阳性(CTC≥2个)患者无进展生存期 7.9个月，CTC阴性患者14.4个月；总生存期分别为10.2个月和21.5个月[18]。另有研究者对Ⅳ期黑色素瘤使用生物化学治疗(顺铂、达卡巴嗪、长春新碱、干扰素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)及生物化学维持治疗(白细胞介素-2和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)，并应用CTC判断疗效[19]。以上2项试验证实了使用CTC判断维持治疗疗效的可行性。

总之，在维持治疗期间尽早发现疾病进展，及早使用二线化疗，可提高患者生存期。如前文所述，CTC检测作为肿瘤患者化疗疗效的动态监测手段已经为人们认可。尽管还没有试验直接验证CTC检测在维持治疗中的应用，但是基于CTC在判断化疗疗效、预测疾病进展等方面的优势，考虑利用CTC检测比现有检测方法能更早、更准确地判断终止维持治疗并开始二线治疗的时机。这一点有待更多临床研究的证实。

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