EB病毒感染与鼻咽癌诊治的研究进展*

孙畅 综述，路顺，郎锦义审校

646000四川 泸州，西南医科大学附属医院 肿瘤科(孙畅);610041成都，四川省肿瘤医院·研究所，四川省癌症防治中心，电子科技大学医学院 放疗科(路顺、郎锦义)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是指起源于鼻咽腔的恶性肿瘤，高发于东亚、东南亚、南亚中部、北非和东非等地，也是我国的高发恶性肿瘤之一[1]。其发病机制由多种因素构成，主要包括：遗传易感性、EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染、饮食与环境因素等[2]。其中，EBV感染是NPC病因中研究最为广泛与深入的病因之一。这也反映出NPC的发生发展与EBV的感染有着密切的关系，并且有望通过对EBV的进一步研究而影响NPC的诊治[2]。

1 EBV

1.1 EBV的感染相关抗原

EBV是人类发现的第一种肿瘤相关线性双链DNA病毒[3]，其感染具有分布广、可流行、多散发等特点。据统计，每年有超过20万的癌症患者与EBV感染相关[4]。在所有因癌症死亡的患者中，有1.8%与EBV感染引起的恶性肿瘤有关[5]。EBV可感染B淋巴细胞及上皮细胞，在感染免疫功能正常的个体后通常会进入休眠状态。尽管如此，该病毒仍能够持续在人体内限制性地通过EBV编码的小RNA和病毒microRNA来表达病毒产物。而在免疫功能低下的宿主体内，EBV于淋巴组织中大量增殖，并可异位感染T细胞与NK细胞等，导致宿主免疫系统功能紊乱[6]。EBV感染人体可分为增殖感染与潜伏感染，因而EBV的抗原也分为增殖感染相关抗原和潜伏感染相关抗原。增殖感染相关抗原主要包括：(1)EBV早期抗原(early antigen,EA)；(2)EBV壳抗原(viral capsule antigen,VCA)；(3)EBV膜抗原(membrane antigen,MA)。其中，EA的出现是EBV活跃增殖的标志，而VCA和MA则属于EBV的结构抗原[7]。EBV潜伏感染时表达的抗原主要分为EBV核抗原(Epstein-Barr virus nuclear antigen，EBNA),包括EBNA1、EBNA2、EBNA3 和主导蛋白(leader protein,LP)等6种核抗原。其中EBNA1被认为是唯一在所有与EBV相关的肿瘤中都表达的病毒编码抗原，是细胞转化必需的抗原；一些EBNA1的特定变种可以改变宿主重要的调控作用，从而打破病毒的潜伏感染，促成EBV相关癌变的发生[8]。EBNA2常被认为是B 淋巴细胞发生转化的必需蛋白，可反式调节潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)，并且能刺激细胞表达CD21 和CD23。EBNA3 包括EBNA 3A、3B 和3C。其中，EBNA 3A与3C是体外B细胞转化的必要基因。LP可通过与EBNA2 酸性反式激活结构域的相互作用，很大程度上增加EBNA2 反式激活LMP1 表达的作用，并且LP也为淋巴母细胞系生长所需[3]。

1.2 EBV病毒标志物与NPC的关系

作为致癌的人类病毒之一，EBV与胃癌、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤等肿瘤关系密切[9]，不同EBV株的生物学特性也指向了不同类型的癌症[10]。尤其是在未分化的NPC中，90%以上的患者呈EBV阳性[11]。NPC细胞在EBV潜伏感染后既可表达编码蛋白基因，例如LMP1、LMP2A与LMP2B等，也能表达非编码蛋白基因，包括EBV编码的小RNAs(EBV-encoded small RNA,EBER)及微小RNA(mini-RNAs,miRNAs)中BamH1 A向右转录[3]。一旦感染EBV，部分病毒基因便可为肿瘤细胞提供有利的生长和生存条件，最终导致NPC的发生或发展。有体外研究表明，细胞周期蛋白D1过度表达有利于维持EBV感染的鼻咽上皮细胞永生化[12]。在EBV阴性的低级别不典型增生病变和正常鼻咽上皮细胞的基因中，3p、9p的缺失已被证实会提高患NPC的风险[3]。EBV感染后出现的基因改变(例如：杂合性丢失的染色体11q、16q、13q与14q)和表观遗传的变异可促使恶性肿瘤发生转移[13-14]， Huang等[15]的研究也证实，NPC发生转移的机制与EBV慢性感染引发的巨噬细胞募集和活化相关。

2 EBV在NPC诊治中的角色

2.1 EBV在NPC诊断分期与筛查的意义

由于NPC的临床症状无明显特异性，患者前往医院行相关检查时往往已为晚期。经统计，我国NPC患者放化疗后，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的5年疾病特异生存率分别为100.0%、96.4%、82.7%和70.4%[16-17]。由此可见，提高NPC的早期筛查与诊断率将很大程度上影响其治疗效果及预后。

已有学者提出，可利用EBV特异性抗体和EBV DNA来诊断早期NPC，且EBV感染后的特异性病理学改变有助于NPC病理学诊断[18]。随着检测技术革新以及对EBV的研究更为深入，目前研究者倾向于联合多种EBV抗体与EBV DNA来进行检测[19]，以提高NPC筛查与早期诊断的特异性与敏感性。我国的人口基数及人群的遗传易感性为NPC的早期筛查提供了有利条件，大样本的联合检验有利于指导研究者筛选出最为敏感与特异性的EBV相关指标，从而提高早期NPC的发现率。

卢煜明教授及其研究团队发布的最新一项研究[20]显示，在20 174名参与实验的香港男性血清样本中，有1 112人的样本里带有EBV DNA(5.5%)。研究人员随后进行了为期4周的二次测试，发现其中309人持续存在EBV DNA，实验者针对这些两次检验都是阳性的部分受试者予以了鼻腔镜和MRI的检查，结果显示其中有34人确诊NPC(11.0%)。此实验中EBV DNA筛查的敏感性和特异性分别为97.1%和98.6%。值得注意的是，在这34名确诊NPC的患者中，有24名患者临床分期为I、II期;与同期香港确诊的NPC相比，I、II期患者的比例要高出许多(70.6% vs 19.3%)。后续的研究也体现出，由于这些患者初诊时癌症处于早期，经治疗后他们的3年无进展生存率要显著高于历史数据(97% vs 70%)。内地也有学者进行了不同的实验，张晓琍等[21]通过对比健康体检者8 884名、有鼻咽局部症状就诊者1 546例与确诊NPC的患者155例中血清EBV抗体水平得出：血清中Rta-IgG、VCA-IgA、EA-IgA抗体的指标对NPC均具有一定临床诊断价值，这3项指标的联合检测，可将NPC诊断的敏感性提高至94.1%，特异性提高至98.9%。俞霞等[22]对比152例初治NPC患者与657例健康体检者血清中EBNA1/IgA、Zta-IgA、VCA-IgA和EBV DNA水平后，得出结论为：对于无症状人群，首选EBNA1/IgA指标来筛查NPC，灵敏度为77.8%；推荐采用血清EBV DNA来辅助诊断晚期NPC患者，灵敏度可达88.8%；联合检测前两项指标的灵敏度为92.1%，特异度为96.9%，并可提高对NPC的诊断效率，Zta/IgA可间接反映淋巴结转移情况，并有望对患者病情评估起到作用。赵新星等[23]检测228名NPC患者与健康人群的对照，得出EBV-Rta/IgG可作为早期筛查NPC的临床指标之一。邱厚匡等[24]收集272例NPC患者，采用Rta-IgG、VCA-IgA、EA-IgA与EBV DNA联合检测后，得出4项指标联合检测时敏感度最高达99.63%，可用于早期NPC患者的筛查，任意2项或2项以上指标呈阳性时应高度怀疑NPC，其特异性在93.0%以上。叶倩等[25]联合4项EBV指标(即Rta-IgG、VCA-IgA、EA-IgA与EBV DNA)检测的研究也得出了相似的结论。另有He等人[26]在研究血浆中非编码长RNA的生物标志物后指出：MALAT1、AFAP1-AS1与AL359062这三个lncRNA指标的水平与EBV感染相关，且对NPC的疗效评估及预后判断具有参考价值。

2.2 EBV与NPC治疗

目前标准的NPC治疗模式是以放射治疗联合化疗为主的综合治疗，但因鼻咽腔的解剖特点及NPC的生物学特性，常规的局部放射治疗常常会累及到周围重要的器官组织，从而引起一系列副反应及后遗症[27]。而今新兴的治疗手段，如免疫及靶向治疗等越来越多地受到研究者关注[28-31]。EBV可以在感染细胞的质膜中诱导多种免疫原性肽的表达，这些EBV相关抗原便可作为抗肿瘤免疫治疗的靶点[32]。同时，EBV在NPC细胞中的持续存在，提示可以利用免疫系统的T细胞识别病毒抗原所表达的部位(EBNA1，LMP1、LMP2等)来靶向定位EBV相关NPC细胞[32]。另外，EBV感染可能会影响NPC靶向治疗的效果。例如，EBV相关的LMP1可介导NPC细胞中表皮生长因子受体(epidermal growth - factor receptor,EGFR)的表达，使NPC细胞对抗EGFR的靶向治疗更敏感[33]。有研究者通过重新构建一种EBV相关EBNA1特异性miRNA表达系统，来探究miRNA与NPC的关系，并证实miRNA中miR-31-5p的靶向表达可以作为新型NPC靶向治疗的切入点[34]。而在探究NPC放疗增敏的过程中，Gao等[35]通过研究EBV编码的微小RNA BamH1 A向右转录7(EBV-encoded microRNA BART7,ebv-miR-BART7)后指出：ebv-miR-BART7可抑制GFPT1和TGFβ1的表达从而降低NPC细胞的放射敏感性；检测NPC细胞中的ebv-miR-BART7基因，可能有助于预测NPC患者的预后及治疗效果。

2.2.1 EBV相关的疫苗 利用疫苗对EBV感染的潜在NPC患者进行预防与治疗，是目前研究的热点[36-37],主要包括预防性疫苗与治疗性疫苗。前者主要以病毒包膜糖蛋白gp350为靶点，依靠接种后体液免疫产生的中和性抗体阻断EBV感染路径来实现预防目的[38]。而LMP2的特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)和树突状细胞疫苗则是针对NPC患者的治疗性疫苗，可以通过识别LMP2抗原表位来发挥定向杀伤和清除EBV感染NPC细胞的作用[28,39]。NPC细胞能较稳定地表达LMP2A，因而LMP2A被认为是NPC免疫治疗的理想靶标。赵玮等[40]通过构建EBV相关LMP2A的减毒单核增生性李斯特菌重组疫苗(recombinant attenuated Listeria monocytogenes vaccine-LMP2A,Lmdd-LMP2A)并检测其在NPC瘤鼠身上的抑瘤效应后发现，与对照组相比，Lmdd-LMP2A能抑制肿瘤生长，并且安全性较好，还能诱导特异性T细胞的免疫应答。Smith等[41]利用新抗原拼接疫苗(adenovirus scrambled antigen vaccine,Ad-SAVINE)对复发与转移的NPC患者进行了临床实验，发现约2/3的实验组患者EBV的CTL水平明显升高，并且接受这种免疫疫苗治疗的患者中位总生存期由220天升至523天，差异具有统计学意义；同时，使用Ad-SAVINE免疫疫苗治疗的安全性与耐受性好，能使NPC患者生存获益。英国研究者[37]开发了一种治疗性新疫苗MVA-EL(modified vaccinia Ankara-EBNA1 and LMP2,MVA-EL)，这种疫苗与EBV标志物中EBNA-1及LMP2的编码有着密切的联系。实验人员用MVA-EL治疗了16例EBV阳性的NPC患者，结果证实此疫苗在多数实验者中耐受性良好且安全，其中8/14例的接种者至少增加了1种抗原,且研究者发现该疫苗可提高实验中不同人种的人类白细胞抗原A*02.01限制性LMP2相关特异性T细胞反应的频率。因此认为其安全性和免疫原性适用于全球不同的EBV阳性肿瘤。

2.2.2 NPC的过继免疫治疗 多项研究报道，过继性细胞治疗可以控制EBV相关NPC患者的疾病进展[42- 44]。在一项Ⅱ期临床试验中，Chia等[45]分析复发或转移的38例EBV阳性NPC患者后发现，在4个周期的吉西他滨+卡铂的化疗后加入6次EBV特异性的CTL过继性免疫治疗，所有患者对免疫治疗耐受性良好，免疫治疗过程中未出现严重的血液和非血液系统毒副反应。相较于使用传统治疗晚期NPC的方案，患者有着更好的生存获益，随访后中位生存期为29.9个月，2年和3年总生存率(overall survival, OS)分别为62.9%和37.1%。研究者提出，对于进展期NPC，化疗联合过继性免疫治疗可能成为一种有前景的治疗模式。Secondino等[46]指出，针对常规治疗失败的EBV阳性NPC患者，在接受化疗后给予高剂量的EBV特异性CTL输注有较好的临床获益，且患者治疗的耐受性及不良反应相对较理想。但也有学者指出[47]，对复发或者转移的NPC患者给予EBV-CTL治疗总体疗效并不理想。对于常规治疗难以控制的NPC，如何提高EBV相关免疫治疗的效果仍需进一步研究。

此外，EBV可以诱导感染细胞的表观遗传学发生改变，如DNA甲基化和组蛋白的去乙酰化，因此EBV引起的遗传学改变被认为是新兴疗法的潜在目标[48]。针对EBV相关NPC抗EGFR药物的II期和III期临床试验也正在进行中[32]。

2.3 EBV与NPC患者的预后

已有研究证实，对EBV DNA滴度的定量检测可用于监测NPC局部复发和转移，作为NPC传统影像学随访的补充手段[49-50]。血浆EBV DNA的高滴度与EBER-RNA的表达被认为与NPC的预后不良和转移扩散相关[51-52]。令狐颖等[53]将130例EBV Zta-IgA与VCA-IgA抗体阳性患者按照抗体滴度分为低、中和高3组，随访后得出Zta-IgA及VCA-IgA抗体的3个滴度组患者平均生存时间的差异具有统计学意义，Zta-IgA组高-中-低滴度的平均生存时间分别约为23.78、27.39、31.11个月，VCA-IgA组则约为23.62、26.96、31.54个月，且Zta-IgA与VCA-IgA抗体水平与NPC患者的总生存期相关，是决定NPC患者预后的独立危险因素。Liu等[54]确定了5种与NPC患者无病生存期(disease-free survival, DFS)关联的EBV相关miRNA，并通过数学建模的方式计算出每名病人5种miRNAs表达值的风险评分，得出与低风险评分患者相比，高风险评分的患者有较短的DFS、OS与疾病无转移生存率，结合对miRNA标志物的识别与TNM分期较单独使用TNM分期来提示临床预后更具价值，并可能指导高进展风险的NPC患者的治疗策略。连仕锋等[55]同时测定EBV相关VCA及EBNAl的IgA抗体，并对结果对应的不同人群拟定不同的NPC患病风险水平，此后定期检测高风险人群的IgA抗体变化。结果提示，此方法能提高NPC的筛查率和早期确诊率。另有学者对比检测接受过治疗的NPC患者的EBV游离DNA(cell-free DNA, cfDNA)与循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)后发现，在反映NPC患者的疗效上，检测EBV cfDNA优于CTCs[56]。但并非所有实验都得出了阳性的结论，Zhou等[57]在研究NPC中程序性死亡受体-配体1(programmed death-ligand 1, PD-L1)与程序性死亡受体1的表达后，发现PD-L1是NPC不良预后的指标，并且与EBV DNA的载量无关。因此，总结并分析目前检测EBV DNA的不同方法，并最终得出有效且可行的检测方式，是现今学者们研究的又一新方向[58]。

3 前景展望

随着全基因测序及新液体活检技术的应用，会使更多EBV阳性的NPC基因靶点与相关标志物被研究出来，同时也将影响NPC的诊治[3]。如何提高EBV相关免疫靶向治疗的安全性与耐受性，还需多中心大样本的临床随机对照试验进行进一步评估和确认。为了更好地诊断和治疗EBV相关肿瘤，还应该实现EBV DNA的标准化检测并找出EBV感染靶细胞的类型。更多深入的研究也应从EBV的角度出发，探寻NPC复发转移及免疫逃逸等方面的机制。此外，如何联合目前已有的放化疗手段与EBV免疫治疗手段，从而建立新的综合治疗方案，将会成为新时代免疫治疗发展的趋势。未来可以期待是，更高敏感性与特异性的EBV抗体标志物的联合筛查，将给NPC高危人群的预防、诊断及随访带来更多的福音。研究者对EBV与NPC的关系不懈探索，对今后NPC的诊治起到积极的指导作用，也从另一方面反映了肿瘤病毒学对整个癌症领域的深远影响。今后更多的研究与发现也将引导我们使用EBV这把老钥匙，打开诊治NPC的新大门。

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