从龙牙楤木药材乙醇提取物中水解楤木皂苷工艺优选

2018-01-13姚丽琴田明

中国中医药信息杂志 2018年1期

姚丽琴++田明

摘要：目的优选从龙牙楤木药材乙醇提取物中水解得皂苷元齐墩果酸的工艺。方法采用Plackett-Burman设计联用CCD效应面法（方法1）与正交试验设计（方法2）对龙牙楤木药材中皂苷元齐墩果酸的水解工艺进行优选。方法1以皂苷元齐墩果酸质量分数为因变量，水解时间、盐酸浓度、料液比为自变量；方法2以皂苷元齐墩果酸质量分数为因变量，以水解时间、水解温度、盐酸浓度、料液比为自变量。采用Design expert 8.0.6 Trial软件进行分析。结果根据试验结果并综合考虑实际生产情况，方法1确定的最佳工艺为加15～18倍量10%～12%盐酸回流水解45～70 min，方法2确定的最佳工艺为加15倍量10%盐酸回流水解60 min。结论 2种方法优选的最佳工艺所得齐墩果酸质量分数相差不大，但方法1直观方便、精密度和重复性高、可预测性好。

关键词：Plackett-Burman设计；CCD效应面法；正交设计；龙牙楤木；齐墩果酸；水解工艺

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.01.013

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）01-0059-05

Technology Optimization of Hydrolyzing Aralia Saponins from Alcohol Extracts of Aralia elata

YAO Li-qin， TIAN Ming

Key Laboratory of Chinese Materia Medica， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150040， China

Abstract： Objective To optimize process of hydrolyzed oleanolic acid from Aralia elata medicinal alcohol extract. Methods Plackett-Burman combined with CCD response surface design method （method 1） and orthogonal experimental design method （method 2） were used to optimize process of hydrolyzed oleanolic acid from Aralia elata medicinal alcohol extract. In method 1， the content of oleanolic acid was the dependent variable， and the hydrolysis time， the hydrochloric acid concentration， and the ratio of material to liquid were set as the independent variables； In method 2， the content of oleanolic acid was the dependent variable， and the hydrolysis time， hydrolysis temperature， the hydrochloric acid concentration， and the ratio of material to liquid were set as the independent variables. Design expert 8.0.6 Trial software was used to analyze the data. Results Considering the actual production situation， method 1 determined the optimum process was to add 15–18 times the amount of 10% to 12% hydrochloric acid， reflux hydrolysis 45–70 min； method 2 determined the optimum process was 15 times the amount of 10% hydrochloric acid， reflux hydrolysis 60 min. Conclusion By comparing method 1 and method 2， the optimum process was selected， and the difference of the content of oleanolic acid is not great. However， the former is more intuitive and convenient， with high precision repeatability， and predictability.

Keywords： Plackett-Burman design； central composite design response surface methodology； orthogonal design； Aralia elata； oleanolic acid； hydrolysis technology

龍牙楤木Aralia elata（Miq.）Seem.又称辽东楤木，是近年来国内外研究频繁的食药材[1-2]，药用部位主要是根皮、茎皮及叶，有效成分总皂苷可达7.0%以上[3-4]，研究表明，其主要含楤木皂苷A、B、C等140余种，其苷元多为齐墩果酸[5]，通过水解皂苷可endprint

通讯作者：田明，E-mail：326080371@qq.com

以得到大量皂苷元齐墩果酸，具有护肝、解毒、降糖、降脂、治疗胃溃疡、抗炎、抗HIV病毒、抗癌、抗氧化、抗突变、利尿等药理作用[6]。齐墩果酸是一种五环三萜类化合物，结构复杂，人工合成繁琐，依赖于植物中提取的天然产物。目前尚无有关龙牙楤木先醇提取总皂苷再水解得到齐墩果酸的含量测定及其水解工艺的研究报道。本研究旨在优化龙牙楤木药材中齐墩果酸的提取工艺，为该植物资源的开发利用提供依据。

Plackett-Burman设计联用CCD效应面法基于非线性模型设计，以直观、方便、精度高和预测性强著称。目前国内在药学制剂工艺优化和处方筛选过程中应用比较成熟的方法为均匀设计和正交试验设计方法。本研究分别采用正交设计和Plackett-Burman设计联用CCD效应面法，优化龙牙楤木药材中皂苷元齐墩果酸的水解工艺，并分析这2种试验设计方法的差异性，为不同设计方法应用于优化中药提取工艺中的可行性提供依据。

1 仪器与试药

赛默飞UltiMate 3000型高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔厂家），FZ102型粉碎机（北京岩征实验仪器有限公司），JD1000-2电子天平（上海卓沈阳龙腾电子称量仪器有限公司），AB204-N电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。

供试样品于2016年2月采自黑龙江通河县清河林业局，原药材经黑龙江中医药大学药学院王振月教授鉴定为龙芽楤木Aralia elata（Miq.）Seem.的根皮及茎皮，置阴凉处，通风干燥后备用。齐墩果酸对照品（中国食品药品检定研究院，纯度98.26%，批号MUST-16070406）；乙醇、盐酸等均为分析纯，乙腈为液相色谱纯，水为去离子超纯水。

2 方法与结果

2.1 齐墩果酸含量测定

2.1.1 色谱条件

ZORBAX SB-C18色谱柱（255 mm×4.6 mm，5 ?m），流动相为乙腈-水（90∶10），检测波长210 nm；流速1.0 mL/min，柱温20 ℃，进样量10 ?L。理论塔板数按齐墩果酸计算应不低于4000。色谱图见图1。表明在此色谱条件下无干扰峰，专属性强[7]。

2.1.2 溶液的制备

取干燥药材适量，粉碎，取约200 g，加80%乙醇加热回流提取2次，第1次加8倍量提取1.5 h，第2次加6倍量提取1 h，合并提取液，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味后，浓缩至50 mL，作为贮备液（即龙牙楤木粗皂苷）。取贮备液1 mL，按各水解工艺水解后抽滤，50～60 ℃低温干燥（盐酸遇热挥发，而且不用去除酸液[8]），加热甲醇适量使溶解，转移至25 mL量瓶中，并加甲醇稀释至刻度，摇匀，定容，即得供试品溶液。

取齐墩果酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得对照品溶液。

注：A.对照品；B.供试品；C.溶剂（甲醇）

图1 龙芽楤木药材醇提取物中齐墩果酸HPLC图

2.1.3 线性关系考察

精密吸取齐墩果酸对照品溶液6、8、10、12、14、16 ?L，按上述色谱条件进行测定，以对照品进样量（?g）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程Y=9.088 9X-1.632 5，r=0.999 9，齐墩果酸在3～8 ?g范围内与峰面积积分值具有良好的线性关系。

2.2 Plackett-Burman试验设计联用CCD效应面法优选水解工艺

2.2.1 Plackett-Burman试验设计

选取对齐墩果酸质量分数影响较大的水解方法（A）、酸浓度（B）、料液比（C）、水解温度（D）、水解次数（E）、水解时间（F）为考察因素[9-10]，并设计3个空白因素，共进行9次试验。根据预试验结果，确定每个因素2个水平。用Design expert 8.0.6 Trial软件设计试验并进行数据处理[11]，Plackett-Burman设计因素水平见表1。

2.2.2 Plackett-Burman试验结果及分析

按表1设计安排进行12次试验，每个试验重复2次，分别测定齐墩果酸质量分数。齐墩果酸质量分数（%）=每1 mL龙牙楤木粗皂苷中齐墩果酸含量×稀释倍数（50）÷龙牙楤木药材取样量×100%。取其平均数作为响应值。运用Design expert 8.0.6 Trial软件对各因素进行显著性分析，P<0.05表示差异有统计学意义。响应值测定结果见表2，各因素显著性分析结果见表3。

由表2、表3可知，各因素对响应值（齐墩果酸质量分数）影响大小顺序为酸浓度>料液比>水解方法>水解时间>水解温度>水解次数。其中酸浓度对齐墩果酸质量分数有显著影响（P<0.05）；虽然水解方法的影响稍大于水解时间，但是发现用硫酸水解后的龙牙楤木粗皂苷在干燥时易碳化，损毁化学结构，且影响色泽，因此选盐酸水解方法。此结论可为下一步CCD效应面设计试验提供可靠依据。

2.2.3 CCD效应面试验设计

根据“2.2.2”项下结果，选取酸浓度（X1）、料液比（X2）、水解时间（X3）为考察因素，每个试验重复2次，分别测定齐墩果酸质量分数，取其平均数作为响应值，优选水解工艺。CCD效应面设计因素水平见表4，CCD效应面试验安排与结果见表5。

使用Statistica软件对表5数据进行多元线性和非线性拟合。多元线性回归方程：Y=3.69+0.25X1+0.13X2+0.11X3，经F检验，r=0.308 3，P=0.043 1，复相关系数较低，拟合度差，预测性差，因此线性模型不适合。多元非线性回归方程：Y=4.08+0.25X1+0.13X2+0.11X3-0.12X1X2-0.24X2X3-0.20X1X3-0.31X12-0.12X22-0.13X32。经t检验，模型方程具有显著性（P<0.05）；r=0.986 6，表明該模型拟合良好，盐酸浓度、料液比与提取时间交互作用显著；预测系数为0.892 3，表明该模型具有较好的实际预测能力。响应面图见图2～图4。在图上选取较佳水解工艺范围：X1为10%～12%，X2为15～20倍，X3为45～70 min。根据Design expert 8.0.6软件分析结果并综合考虑实际生产情况，选取龙牙楤木最佳水解工艺为加15倍量10%盐酸水解60 min。endprint

2.2.4 水解工艺验证试验

按优选出的水解工艺进行3次验证试验，比较齐墩果酸质量分数的预测值与真实值。结果预测值为4.16%，真实值为（4.18±0.15）%，RSD=0.24%，预测值与真实值的偏差为-0.48%。

2.3 正交试验设计优选龙牙楤木粗皂苷水解工艺

根据预试验，选取盐酸浓度（A）、料液比（B）、水解时间（C）、水解温度（D）为考察因素，每个因素选3个水平，以齐墩果酸质量分数为评价指标，采用L9（34）正交表安排试验，优选适宜的水解工艺。正交试验因素水平见表6，试验结果见表7，方差分析见表8。

由表7、表8可知，各因素对龙牙楤木提取物经盐酸水解后皂苷元齐墩果酸质量分数影响的顺序为A>B>C>D，考虑实际生产中的水解效率、能耗、生产成本等诸多因素，需对水解工艺进行综合评价，最终确定水解工艺为A2B2C2D3，即加15倍量10%盐酸100 ℃回流水解1 h。

根据最终优选出的水解工艺进行3次验证试验，结果齐墩果酸平均质量分数为4.26%，RSD=1.85%。

3 讨论

Plackett-Burman设计是基于因素间无交互影响时，优选因素主效应而进行的多因素高、低2个水平的试验设计；CCD效应面设计是基于五水平的二次式试验设计，是由二水平析因设计加轴点及中心点组成，该设计具有可旋转性，因此试验精密度高。两设计联用，集数学与统计学为一体，能快速有效地筛选最佳工艺。正交试验设计是国内比较成熟的试验设计方法，虽可以满足一般试验的需求，在试验处理时能够取得佳点，但是试验紧密度不够高，建立的数学模型预测性较差。

迄今國内关于龙牙楤木中皂苷元齐墩果酸含量测定的文献报道较少[7，12]，且得率低。本研究先用乙醇溶媒提取龙牙楤木，得到粗皂苷，再对粗皂苷进行盐酸水解得皂苷元齐墩果酸工艺进行了较为彻底的试验研究，2种优选水解工艺中龙牙楤木的质量分数均较高，均不低于4.0%，比传统工艺[13]得率高2.55倍。经比较发现，Plackett-Burman联用CCD效应面法工艺所得齐墩果酸质量分数与正交试验设计工艺结果差异不大，但前者试验可预测性优于后者，而且前者重复性（RSD=0.24%）较后者（RSD=1.85%）明显提高。试验结果显示，在2种工艺优选中盐酸浓度均为主要影响因素（P<0.05）。预试验也考察了超声法与回流法的优劣，发现回流法效果优于超声法。通过不同试验设计及其比较，优选出了龙牙楤木醇提取物可稳定水解皂苷元齐墩果酸的最佳条件。

目前，龙牙楤木的研究主要集中在化学成分和药理研究2个方面[14-17]，其开发利用主要集中在总皂苷药理作用及提取的层面上，而对单体化合物开发利用极少，希望通过对各单体化合物相关药理作用的物质基础和作用机制研究，为龙牙楤木的深度开发利用提供依据。

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